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2017年终大事记
2018年已经到来，首先恭祝各位同仁新年快乐，预祝新的一年里大家能有更好的成果，生活幸福，身体健康！
在刚刚过去的2017年里，circRNA领域有一系列激动人心的成果，包括首次证明circRNA可以直接翻译多肽，首次发现circRNA存在m6A修饰等等。2017年是circRNA研究的丰收年，不仅在circRNA相关的基础生命科学问题的方面的重大进展，还在相关疾病的机制研究，信息学和数据库工具，涉及的学科领域方面都有巨大的进步。2017年国家自然科学基金也捷报频传，杰出青年基金，优秀青年基金，重点项目等都有斩获，总受理数量高达176项！实现了三连升。为方便同行回顾相关进展，山人借此机会给大家梳理了一下2017年度circRNA的主要研究进展，由于涉及的论文体量巨大，面面俱到不太现实，就抽取了有代表性的方向和进展，其余的以列表的方式总结在相关分目录的后面，以方便大家查阅。
第一章目录
1
circRNA基本生命科学问题研究进展
1.1 circRNA能直接翻译多肽
1.2 circRNA组织/疾病特异性表达机制与功能研究进展
1.3 circRNA参与生理活动功能机制研究
1.4 circRNA存在m6A修饰
1.5 其他circRNA基础生命科学问题研究报道汇总
1. circRNA基本生命科学问题研究进展
circRNA是生命遗传信息传递和发挥作用过程中一个非常奇特的产物，目前的研究表明circRNA也是服从中心法则的，但与传统的核酸分子又有巨大的差别。主要表现在没有游离的末端，由此导致了circRNA具有不同于传统线性核酸分子的独特结构和功能。正因如此，关于circRNA如何形成和发挥作用的问题吸引了众多国内外研究者的好奇心。circRNA有关的基本生命科学问题的每一个进展也格外激动人心。2017年有关circRNA的基本生命科学问题取得了巨大的进展，主要体现在首次证明circRNA具有翻译潜能，首次报答发现circRNA也具有m6A修饰，与此同时，关于组织/疾病/生理活动特异性的circRNA表达机制和功能机制也取得了长足进步。下面就让我们一起回顾一下吧：
1.1 circRNA能直接翻译多肽
一直以来，circRNA被认为是一种非编码RNA，但这一认识在2017年被打破了，先后有4篇研究论文报道发现并证实了circRNA可以翻译多肽，这无疑是2017年度circRNA研究领域最重要的进展之一，Science，Nature等知名杂志也对此做过专门的评论。
circRNA存在m6A修饰，并且该修饰能促进circRNA翻译
3月10日，Cell Research杂志在线发表了中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的研究论文，介绍发现了circRNA中m6A修饰，并且该修饰能促进circRNA翻译[1]。
在本文中，王教授给出的m6A修饰调控circRNA翻译的机制是：由METTL3/METTL14-WTAP蛋白复合物进行m6A修饰，FTO进行m6A去修饰调控。含有m6A修饰的位点通过募集YTHDF3进而募集eIF4G2，进而启动蛋白翻译过程。该论文具有里程碑式的重要意义，首先证明了circRNA可进行翻译活动，其次，还是首次报道circRNA存在m6A修饰，填补了circRNA化学修饰方式研究的空白[1]。
图1 m6A修饰调控circRNA翻译（来自[1]）
circ-FBXW7可翻译蛋白并在胶质瘤中发挥重要作用
8月29日，JNCI杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩副教授为通讯作者的文章，介绍发现circ-FBXW7可以翻译一种抑制胶质瘤的全新蛋白质[2]。
文章报道发现circ-FBXW7可直接翻译蛋白FBXW7-185aa，与母基因编码的FBXW7蛋白协同调控c-Myc的稳定性，抑制恶性胶质瘤的发生进展。本项发现首次证明circRNA所翻译的蛋白与母基因的蛋白表达产物协同作用，共同发挥功能[2]。该研究再次打破了科学界以往将circRNA看作“非编码RNA”的传统认识，进一步拓展了circRNA的研究思路，对circRNA功能研究具有极高的参考价值。
图2 circ-FBXW7可直接翻译蛋白（来自[2]）
Molecular Cell文章介绍发现circRNA可翻译蛋白
3月15日，Molecular Cell在线发表了以色列希伯来大学的Sebastian Kadener教授，介绍基于果蝇大脑中核糖体印迹分析（ribosome footprinting）发现大量的circRNA翻译蛋白或多肽的情况[3]。
作者在果蝇的大脑组织中进行核糖体印迹分析，发现了有些circRNA可以结合到核糖体上，于是作者认为circRNA有可能具有翻译蛋白的功能。经过一系列的严谨实验论证，作者得出结论：部分circRNA可翻译蛋白。核糖体印迹分析中证明circMbl中的终止密码子处有核糖体结合。circMbl所编码的蛋白在蛋白质谱中得到证据[3]。
图3 果蝇CircMbl可翻译蛋白 （来自[3]）
Circ-ZNF609可直接翻译蛋白并参与肌肉发生过程
3月16日，Molecular Cell杂志在线发表了意大利罗马萨皮安扎大学Irene Bozzoni教授，介绍发现了circRNA Circ-ZNF609可直接翻译蛋白，该蛋白参与肌肉发生过程[4]。
文中作者首先筛选与肌肉发生有关的circRNA，人和小鼠中都进行了筛选，还选择了杜氏肌营养不良疾病模型一并进行筛选。最终筛选到一批特征性的circRNA，接着，作者又针对这些circRNA进行了RNAi文库筛选，以找出对肌肉发生功能有关的circRNA。基于这一系列的筛选，作者最终发现了Circ-ZNF609。接下来针对Circ-ZNF609的功能研究作者验证了其翻译多肽的功能，并针对该功能进行了一系列的生化验证实验[4]。
图4 circ-ZNF609可直接翻译蛋白并参与肌肉发生过程（来自[4]）
1.2 circRNA组织/疾病特异性表达机制与功能研究进展
大量研究表明circRNA存在组织/疾病特异性的表达特征，形成机制还不完全清楚。2017年有多篇文献报道揭示了一些组织/疾病特异性的circRNA形成机制。
Naure报道：RNA解旋酶DHX9特异性结合反向Alu元件调控RNA加工和circRNA形成
3月29日，Nature杂志在线发表了德国马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar教授为通讯作者的Letter文章，介绍发现反向Alu元件通过RNA解旋酶DHX9调控RNA转录后加工过程。DHX9缺失会导致circRNA增多，为反向Alu元件调控RNA转录产物加工过程提供了全新的机制模型[5]。
人类基因组含有大量的转座性元件，其中包括以Alu元件为代表的短散在序列（SINE），约占到了人类基因组的10%左右的体量。在这篇文章中，作者发现RNA解旋酶DHX9特异性识别反向重复Alu元件。DHX9缺失会导致RNA转录后剪接异常，circRNA增多[5]。
图5 DHX9特异性结合反向互补Alu元件调控RNA加工与circRNA形成（来自[5]）
Molecular Cell杂志发表circRNA形成机制重要文章
11月22日，Molecular Cell杂志在线发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Jeremy E. Wilusz教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA形成调控的新机制，杨力教授和陈玲玲教授为本文的共同作者。
研究circRNA的同行一定会注意到这个现象：同一个基因来源的linear RNA与circRNA的含量有时有相同的对应关系，有时却恰恰相反。本文作者的初衷正是希望找出决定linear RNA与circRNA相对量的机制。基于RNAi筛选，作者利用果蝇细胞中构建的Mini基因报告系统，发现了剪切体组分及转录终止相关的基因被干扰之后能显著增加circRNA的丰度，并进一步在体内和体外验证了相关的现象[6]。本文的发现为circRNA形成的调控机制提供了非常有价值的信息。
图6 剪接异常或转录通读促进circRNA形成（来自[6]）
NF90/NF110通过促进内含子互补序列稳定性促进circRNA形成
6月15日，Cell子刊Molecular Cell杂志在线发表了陈玲玲教授和杨力教授为共同通讯作者的文章，报道发现病毒感染相关因子NF90/NF110通过促进内含子互补序列稳定性促进circRNA形成[7]。
本文主要报道发现了病毒感染相关的因子NF90/NF110参与circRNA的形成过程。是通过RNA干扰文库筛选鉴定出来的，NF90/NF110通过稳定内含子互补序列结构促进circRNA的形成。病毒感染的条件下，诱导NF90/NF110出核并抑制病毒复制，circRNA生成量也随之降低[7]。
图7 病毒感染相关因子NF90/NF110调控circRNA形成（来自[7]）
RNA结合蛋白FUS调控神经元circRNA形成
3月30日，Nature Communication杂志在线发表了罗马萨皮安扎大学Mariangela Morlando教授和意大利技术研究所Irene Bozzoni教授为共同通讯作者的文章，介绍发现RNA结合蛋白FUS在神经元中介导RNA反向拼接活动，与circRNA的形成有关[8]。
文中作者首先比较了FUS基因敲除前后自ES分化的运动神经元中circRNA的表达状况，发现FUS敲除后有一批circRNA的表达明显降低。接着基于RNA干扰和过表达ALS疾病相关的FUS基因后circRNA的表达变化情况，最终明确了FUS蛋白在神经元中调控了RNA反向拼接的作用，与circRNA的形成有关[8]。
图8 FUS敲除对运动神经元circRNA的影响（来自[8]）
HNRNPL调控可变剪切和circRNA生成
6月13日，PNAS杂志在线发表了一篇前列腺癌中筛选RNA拼接因子的文章，介绍基于CRISPR基因打靶文库筛选体系，鉴定到与前列腺癌有关的RNA拼接因子HNRNPL，该因子也参与调控了circRNA的形成过程[9]。文章的通讯作者为东北大学生命科学与健康学院“青年千人计划”费腾教授，哈佛大学公共健康学院/Dana-Farber癌症研究所X. Shirley Liu教授和Dana-Farber癌症研究所/哈佛大学医学院Myles Brown教授。
本文作者利用CRISPR的全基因组打靶文库筛选与前列腺癌有关的基因，聚类分析后找出了其中与RNA编辑有关的基因，其中HNRNPL是影响最为显著的。接下来作者分析了HNRNPL结合RNA的序列特异性，并基于RIP-Seq分析了该基因在前列腺癌细胞中调控RNA可变剪切和circRNA形成的作用[9]。
图9 HNRNPL调控RNA可变剪切和circRNA的生成（来自[9]）
人干细胞多能性相关circRNA形成机理研究
10月27日，Nature Communications杂志在线发表了台湾中央研究院Kuo Hung-Chih为通讯作者的文章，报道发现circBIRC6参与干细胞多能性调控[10]。
文章报道发现干细胞中特异的RNA剪切因子ESRP1调控了circBIRC6的形成过程，circBIRC6通过竞争性结合miR-34a和miR-145参与调控干细胞多能性。ESRP1受到Oct4，Nanog等转录因子的调控。本文首次报道干细胞多能性相关的circRNA分子，是circRNA功能研究的重要扩展[10]。
图10 体外分化实验分析多能性相关circRNA分子（来自[10]）
1.3 circRNA参与生理活动功能机制研究
circRNA的功能一直滞后于表达谱分析的研究，这一局面在2017年有所改变，2017年出现了多篇关于circRNA功能的研究报道，越来越多的证据表明circRNA参与了诸多重要的生理或病理过程。由于疾病相关的circRNA研究体量巨大，后面会单独按照不同疾病类型进行分析汇总。
Science杂志发表重磅级circRNA研究论文
8月10日，Science杂志在线发表了著名RNA研究学者，马克斯·德尔布吕克分子医学中心Nikolaus Rajewsky教授作为通讯作者的研究论文，介绍其发现的Cdr1as基因敲除小鼠模型中的重要发现[11]。这是2000年以来circRNA研究领域首次问鼎该杂志，意义非凡。
本文首次尝试构建了circRNA基因敲除小鼠模型。通过合理设计，构建了彻底敲除全长CDR1as的小鼠模型，也因为所对应的互补链上CDR1基因恰好不在大脑中表达，这一敲除模型做到了单一因素敲除的效果，避免了其他因素带来的干扰。基于前期的研究，CDR1as可竞争性结合miR-7，并且受到miR-671的调控。作者从转录组到神经电生理检测，再到行为学研究，打通了CDR1as竞争性结合miR-7的分子模型在动物生理行为表型关系方面的通道，有效回到了该功能模型的生理意义问题[11]。
图11 CDR1as敲除小鼠鉴定（来自[11]，排列稍有改动）
果蝇母系遗传内含子来源circRNA调节发育进程
3月17日，Cell子刊Current Biology在线发表了新加坡国立大学Jun Wei Pek教授为通讯作者的文章，介绍发现母系遗传的内含子来源circRNA sisR-4调控宿主基因的表达并影响发育过程[12]。
文中作者一开始希望找出果蝇发育过程中母系遗传的内含子来源的circRNA，经过RNase R处理后测序，找到了5个circRNA，再结合遗传特性，确定CG9775 和deadpan基因内含子来源的circRNA符合要求。作者在本文中重点探讨了来源于deadpan基因内含子的circRNA sisR-4在胚胎发育过程中的作用以及与宿主基因deadpan的关系。最终结果表明sisR-4可以母系遗传的方式通过提高宿主基因的表达在发育过程中发挥作用[12]。
图12 内含子来源的circRNA sisR-4调控宿主基因表达和发育过程（来自[12]）
细胞识别内源和外源circRNA的机制
6月15日，Molecular Cell杂志在线发表了一项重要的circRNA研究成果，介绍发现了细胞识别内外源circRNA的机制。文章的通讯作者是斯坦福大学医学院的Howard Y. Chang教授[13]。
文中作者尝试基于体外转录后自动拼接环化获得circRNA，以此转染细胞，意外的发现了体外获得的circRNA会诱导细胞自身免疫效应通路的激活，并抑制RNA病毒的感染过程，该过程由RIG-I介导，内源的circRNA由于结合一些RNA结合蛋白而不会诱导该通路[13]。
图13 外源circRNA结合RIG-I诱导免疫通路激活（来自[13]）
circRNA参与调控自噬相关通路
2017年共有2篇高水平的文章报道了circRNA与细胞自噬通路的关系，东南大学姚红红教授分别在8月8日和12月20日在Autophagy杂志在线发表了相关的研究工作。下面一起回顾一下这些研究报道：
8月8日，Autophagy杂志在线发表了东南大学姚红红教授为通讯作者的文章，介绍发现circHIPK2通过靶向miR-124-2HG联合自噬及内质网应激调控星形胶质细胞活化作用[14]。
本文作者在前期研究中层发现SIGMAR1在甲基苯丙胺诱导的星形胶质细胞活化过程中的作用，本文在此基础上进一步发现circHIPK2作为miR124-2HG的内源竞争性RNA，负调控该miRNA的活性，增加SIGMAR1的表达。体内和体外敲低circHIPK2后可促进miR124-2HG的功能，进而抑制SIGMAR1的功能，进而影响自噬和内质网压力通路，最终影响星形胶质细胞活化过程[14]。
图14 circHIPK2通过miR124-2HG调控SIGMAR1影响星形胶质细胞活化（来自[14]）
12月20日，Autophagy杂志在线发表了东南大学姚红红教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA HECW2参与ATG5的非自噬作用，涉及EMT过程[15]。
本文主要介绍发现circHECW2通过竞争性抑制miR-30D，释放ATG5，并进而促进Notch1信号通路，在上皮-间充质转变（EMT）通路中起作用[15]。
图15 circHECW2参与调控EMT通路 （来自[15]）
circRNA参与二氧化硅诱导巨噬细胞活化作用
2018年1月1日，Theranostics杂志在线发表了东南大学医学院生理学系巢杰教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA通过HECTD1 / ZC3H12A依赖的泛素化通路介导二氧化硅诱导的巨噬细胞激活，姚红红教授为共同作者[16]。
该项研究揭示了二氧化硅诱导的巨噬细胞激活与circHECTD1 / HECTD1途径之间的联系，从而提供了新的洞察到HECTD1潜在用途在治疗矽肺治疗策略的发展[16]。
图16 circHECTD1 / HECTD1途径与二氧化硅诱导巨噬细胞活化的关系 （来自[16]）
Theranostics报道circ-Amotl1参与心肌修复作用
8月29日，Theranostics杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现circ-Amotl1通过结合PDK1和Akt促进Akt的磷酸化，并进一步转移入核，抑制细胞凋亡，促进心肌修复[17]。
作者首先发现新生儿心脏中存在一种高表达的circRNA：circ-Amolt1。进一步的研究表明circ-Amolt1可以通过与PDK1和Akt1共同相互作用，促进Akt1的磷酸化和入核。在体外的细胞以及多柔比星诱导的心肌病模型中进一步证实了该机制。已知Akt1的入核在心脏保护作用中起到信号节点的作用，本文所提出的功能机制模型是对已知模型的补充，也证明了circRNA通过与蛋白的相互作用促进蛋白功能，对于circRNA功能研究具有非常高的参考价值[17]。
图17 circ-Amotl1结合Akt1促进其磷酸化和入核（来自[17]）
ciRS-7序列隐含在一个lncRNA的序列中
12月20日，PLOS Genetics杂志在线发表了美国斯坦福大学斯坦福大学医学院生物化学系Julia Salzman教授为通讯作者的文章，介绍发现ciRS-7序列隐含在一个lncRNA的序列中[18]。该报道还曾于10月17日在预印本杂志BioRxiv上发布过。
Salzman教授通过开发新的启动子算法，证明ciRS-7与长的非编码RNA LINC00632的启动子一致。在基于多个正交实验分析验证了这个预测结果。这一研究揭示了ciRS-7的形成机制，也是经过转录后剪切形成的[18]。
图18 ciRS-7与长的非编码RNA LINC00632的外显子结构（来自[18]）
circRNA通过诱导c-Myc入核促进肿瘤生成
6月16日，Nature子刊 Cell Death & Differentiation在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现了circRNA circ-Amotl1通过诱导c-Myc入核而促进肿瘤发生[19]。也是在今年，杨教授也曾发表论文证明circ-Amotl1在心肌修复过程中起作用。
文中作者围绕circRNA circ-Amotl1在肿瘤中的作用机制展开了相关探索研究，发现circ-Amotl1能够通过诱导c-Myc入核促进肿瘤生成[19]。文中使用了RIP的实验技术，证明了circRNA与蛋白的相互作用。
图19 过表达circ-Amotl1促进肿瘤生成（来自[19]）
1.4 circRNA存在m6A修饰
核酸分子的化学共价修饰是普遍存在的生命活动过程，已有大量的文献报道发现了大量的DNA和RNA中存在的化学修饰方式。然而circRNA中的相关报道却一直是空白，这个方向也在2017年获得了突破，2017年共有两篇文章和一篇预印本文章报道发现了circRNA中存在m6A修饰。其中一篇便是上面提到的王泽峰教授发表在Cell Research杂志的研究论文。此外还有一篇Cell Reports文章和BioXrive预印本的文章报道证明circRNA存在m6A修饰：
Cell Reports报道发现circRNA存在细胞特异性m6A修饰
8月29日，Cell子刊Cell Reports在线发表了哈佛大学医学院Cosmas C. Giallourakis和Alan C. Mullen为共同通讯作者的文章，介绍发现circRNA广泛存在m6A修饰，且呈现细胞特异性的特征[20]。该研究结果曾在3月10日发表于国际著名预印本杂志BioRxiv。
本文进一步证实了circRNA中存在m6A修饰，还发现了一些m6A修饰的circRNA 的特征，包括：（1）m6A修饰的circRNA所对应的线性RNA中同一位置很少被m6A修饰，mRNA更倾向于在其3’UTR区携带m6A修饰。（2）m6A修饰的circRNA呈现高度的细胞特异性分布，相同的circRNA分子在不同的细胞中m6A修饰的状态也不尽相同。（3）m6A修饰的circRNA往往对应于较大的外显子区域，且两侧倾向于存在转座元件。（4）circRNA与线性RNA有共同的修饰酶和识别酶。METTL3参与circRNA的m6A修饰， YTHDF1/YTHDF2参与识别。（5）m6A修饰的circRNA所对应的mRNA相对更不稳定[20]。
图20 细胞特异性m6A修饰circRNA表达特征（来自[20]）
1.5 其他circRNA基础生命科学问题研究报道汇总
第二章目录
2
circRNA与疾病相关性研究进展
2.1 circRNA与肿瘤
2.2 circRNA与心血管疾病
2.3 circRNA与其他人类疾病
2. circRNA与疾病相关性研究进展
circRNA与疾病的相关性一直是研究的重点领域，以肿瘤学为代表，2017年循环系统相关的研究也表现出迅速增长的态势。疾病相关性的研究大致思路相似，主要是首先基于高通量分析（二代测序或芯片法分析），找出疾病相关的特异性circRNA分子，然后预测分析其可能相互作用的miRNA分子和网络，进行通路分析。严谨的实验会基于各种验证实验对所提出的模型进行相关验证分析。
2.1 circRNA与肿瘤
肿瘤学依然是circRNA研究的主要阵地，在传统的思路基础上，2017年的肿瘤学相关报道也发生了一定的变化，主要体现为特定circRNA的研究报道明显增多，竞争性结合miRNA分子不仅仅局限在生物信息学预测，还增加了实验验证。由于肿瘤学是个非常庞大的领域，按照不同种类的肿瘤，细分如下：
2.1.1 肝癌相关circRNA研究进展：
Hepatology杂志报道CircMTO1在肝细胞癌中的作用机制
5月18日，国际肝脏学杂志顶尖Hepatology杂志在线发表了曹雪涛院士的研究论文，介绍肝癌中环形RNA的研究工作，介绍发现了环形RNA CircMTO1通过竞争性结合miR-9抑制肝细胞癌增殖[21]。曹雪涛院士和第二军医大学于益芝教授为共同通讯作者。
首先，本文揭示的circMTO1在HCC中表达特征非常显著，且与肿瘤的预后相关性很强，具有非常重要的临床研究和应用价值。意义大价值高的东西更容易受到优秀杂志的青睐。其次，本文提出的分子机制证据充分，论证严谨。本文发现的circMTO1竞争性结合miR-9的分子机制模型经过了反复的论证，RIP实验和FISH实验非常有力的支持了circMTO1竞争性结合miR-9的结论，后续在细胞和动物模型的实验也很好的支持了circMTO1通过竞争性结合miR-9发挥对肿瘤的影响的假设 [21]。本文所展示的实验结果严谨而有力，不拖泥带水，简洁明了而又强有力的论证了所提出的机制模型，在已发表的miRNA Sponge功能模型的文章中也是比较难得的。清晰有力的逻辑论证也是本文的一大亮点，这也是高水平杂志能认可该工作的一个重要原因。
图21 circMTO1的肿瘤内沉默促进体内HCC的生长（来自[21]）
RNAZKSCAN1与circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移
2月16日，Molecular Oncology杂志在线发表了中山大学附属第三医院刘波和杨扬为共同通讯作者的文章，介绍发现ZKSCAN1基因和它的circRNA产物circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移[22]。
文中作者在102例肝细胞癌临床标本中分析了ZKSCAN1与circZKSCAN1的表达情况，发现癌组织中两种RNA分子均降低，两种分子过表达后均抑制肝细胞癌增殖和迁移，RNA-Seq结果表明两种分子的作用机制有所差别[22]。
图22 ZKSCAN1与circZKSCAN1以不同机制发挥作用（来自[22]）
其他肝癌相关circRNA研究报道
2.1.2 胃癌相关circRNA研究进展：
胃癌中circLARP4竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达
9月11日，Molecular Cancer杂志在线发表了上海交通大学第六人民医院朱金水教授为通讯作者的文章，介绍发现胃癌中circLARP4通过竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达[23]。
文章作者曾报道LATS1基因在Hippo通路中的作用，在胃癌中LATS1起到类似抑癌基因的作用。本文中作者首先分析了miR-424-5p与LATS1在胃癌中的表达关系以及与临床信息的对应关系，证明miR-424-5p与LATS1的表达量存在负相关。miR-424-5p表达越高，LATS1表达就越低，所对应的胃癌分级就越高，预后也越差。进一步的研究证明miR-424-5p可直接调控LATS1的表达。由于大量的文献报道表明circRNA可以通过竞争性抑制miRNA发挥作用，因此作者基于circRNA表达谱分析，circBase数据库检索及miRNA作用位点分析软件综合分析后筛选出了30种候选circRNA分子。由于胃癌中miR-424位高表达，因此作者挑选15种低表达的circRNA分子进行下一步分析，其中只有来源于LATS1基因第9,10外显子的circRNA（circLARP4）最符合要求。后续实验证明了circLARP4竞争性结合miR-424-5p，所用的实验技术包括双荧光素酶报告系统，RIP实验，FISH等。
图23 胃癌中circLARP4的作用机制（来自[23]）
其他胃癌相关circRNA研究报道
2.1.3 膀胱癌相关circRNA进展报道
circHIPK3在膀胱癌中竞争性抑制miR-558
8月9日，EMBO Reports杂志在线发表了华中科技大学同济医学院曾甫清教授和蒋国松教授为共同通讯作者的文章，介绍发现膀胱癌中circHIPK3通过竞争性结合miR-558抑制乙酰肝素酶表达[24]。
作者利用RNA-Seq分析了膀胱癌中circRNA差异表达的情况，共得到6154种差异表达的circRNAs，其中circHIPK3显著低表达。过表达实验表明circHIPK3可明显抑制膀胱癌细胞系的增殖和迁移。分子机制方面，作者利用了miRanda、PITA和RNAhybrid三种工具预测了可能相互作用的miRNA，比对分析后找出了12种完全重叠的miRNA分子。然后又通过RNA Pull-down实验证明了miR-558与circHIPK3有相互作用，荧光原位杂交实验进一步验证了这一相互作用[24]。
图24 circHIPK3竞争性结合miR-558（来自[24]）
circRNA MYLK作为内源竞争性RNA在膀胱癌在发挥重要作用
7月4日，Cancer Letters杂志在线发表了重庆医科大学陈俊霞教授为通讯作者的研究论文，介绍发现circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2信号通路促进膀胱癌发生发展[25]。文章通过严谨的实验有力地论证了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进BC的发生发展，是一篇难得的miRNA sponge功能模型的文章。
作者利用微阵列芯片分析了4对人膀胱癌（BC）标本的癌及癌旁组织，发现circRNA MYLK与VEGFA在癌组织中共同高表达。然后通过扩大组织标本数量，与临床症状相关性分析等，表明circRNA MYLK可促进膀胱癌发生发展。然后基于预测和验证实验，最终阐明了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进膀胱癌的发生发展[25]。
图25 circRNA MYLK的筛选及其与VEGFA的关系（来自[25] ）
CircRNA在膀胱癌早期诊断中的研究
11月28日，新开放的Nature子刊npj Genomic Medicine在线发表了丹麦奥胡斯大学Jakob Skou Pedersen教授和Trine Line Hauge Okholm教授为共同通讯作者的文章，介绍在膀胱癌中筛选circRNA的工作，Jørgen Kjems教授为共同作者[26]。
本文作者从早期的膀胱癌角度出发，考察circRNA是否可以作为膀胱癌潜在的临床诊断标记物，收集了457个NMIBC（(348Ta和109T1）非肌层浸润性膀胱癌标本进行全转录组高通量测序分析。鉴定出15223个circRNAs分子，设定阈值筛选出279个高表达的circRNAs分子进一步与临床特征进行关联分析，发现13个circRNAs与膀胱癌的进展存在相关性，可以作为潜在的诊断分子指标[26]。
图26 膀胱癌相关circRNA筛选鉴定 （来自[26]）
其他膀胱癌相关circRNA研究报道
2.1.4 结肠直肠癌相关circRNA进展报道
circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移
3月1日，Cancer Research杂志在线发表了台湾国立成功大学Shaw-Jenq Tsai博士和H. Sunny Sun博士为共同通讯作者的文章，介绍发现circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移[27]。
文章作者首先通过测序筛选结肠癌相关的circRNA，作者挑选了circCCDC66进行深入探索分析。发现circCCDC66能促进结肠癌细胞增殖和迁移。在结肠癌中circCCDC66过表达，并与结肠癌的临床症状表型有相关性[27]。
图27 circCCDC66促进结肠癌增殖和转移（来自[27]）
其他结肠直肠癌相关circRNA研究报道
2.1.5 其他类型肿瘤相关circRNA进展报道
胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制
2月20日， Journal of Hematology & Oncology杂志在线发表了中国医科大学附属盛京医院刘云会教授为通讯作者的文章，介绍关于在胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制的研究[28]。
文章发现胶质瘤中circ-TTBK2上调而线性基因没有明显改变。过表达circ-TTBK2促进细胞增殖和迁移并抑制凋亡作用。与此同时，作者发现miR-217在胶质瘤中下降。进一步，作者发现circ-TTBK2可以作为miR-217的miRNA Sponge但线性的TTBK2没有这种作用。强制表达miR-217可抵消circ-TTBK2的作用[28]。
图28 胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制 （来自[28]）
口腔癌中circRNA_100290竞争性结合miR-29家族发挥作用
4月3日，Nature子刊Oncogene在线发表了湘雅二院L Chen为通讯作者的文章，介绍发现circRNA circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用[29]。
在本中，作者通过芯片法分析了口腔癌和癌旁组织中circRNA的表达情况，发现了circRNA circRNA_100290与CDK6均在口腔癌中高表达。干扰circRNA_100290后CDK6表达也下降，且细胞增殖受到抑制。进一步通过荧光素酶报告系统，作者发现了circRNA_100290可以通过竞争性结合miR-29家族的分子发挥作用[29]。
图29 circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用（来自[29]）
环形RNA作为新型的乳腺癌诊断标志物
4月21日，Oncotarget杂志在线发表了南京医科大学王建明教授为通讯作者的文章，介绍一项在乳腺癌中开展的环形RNA差异表达分析，验证及疾病相关性分析的工作[30]。
本中作者共鉴定到1155种差异表达的环形RNA，其中715种上调。进一步鉴定后表明 hsa_circ_103110、 hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821明显上调，而hsa_circ_006054、 hsa_circ_100219和 hsa_ circ_406697明显下调。最后在疾病相关性分析中发现联合 hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和 hsa_circ_406697后ROC曲线的AUC值能达到0.82，可作为有效的乳腺癌疾病诊断标志物[30]。
图30 三种环形RNA联合作为乳腺癌诊断标志物（来自[30]）
下咽鳞状细胞癌中差异表达环形RNA鉴定分析
4月27日，Oncotarget杂志在线发表了山东大学齐鲁医院耳鼻喉科潘新良主任和雷大鹏主任为共同通讯作者的文章，介绍一项在下咽鳞状细胞癌中环形RNA的研究工作[31]。
作者通过环形RNA芯片在4例下咽鳞状细胞癌（HSCC）和对应的癌旁组织中筛选分析差异表达的环形RNA，共得到2392种差异表达的环形RNA，其中1304种为上调。接下来作者又在32例标本中验证了所筛选到的差异最大的各10种环形RNA。作者也针对这些差异表达的环形RNA进行了竞争性结合miRNA预测和通路预测分析。
图31 下咽鳞状细胞癌中差异表达的环形RNA（来自[31]）
ANRIL在黑色素瘤中存在多种Isoform形式
6月27日，International Journal of Molecular Sciences杂志在线发表了新西兰奥克兰大学Graeme J. Finlay教授和Marjan E. Askarian-Amiri教授为共同通讯作者的文章。介绍发现在黑色素瘤中非编码RNA基因ANRIL存在多种Isoform形式，其中也包括circRNA[32]。
有报道表明非编码RNA 基因ANRIL的剪切方式存在组织特异性的特征，但有关该基因的剪切方式还缺少系统性的研究。本文作者选择两株黑色素瘤细胞进行分析，发现了ANRIL的剪切方式存在细胞类型特异性，也发现了该基因对应的circRNA。线性的ANRIL的主要定位于核内，而circ-ANRIL定位于胞质[32]。
图32 ANRIL功能通路（来自[32]）
白血病中MYC扩增区对circRNAs表达影响
11月28日，Leukemia杂志在线发表了意大利巴里奥尔多大学生物系Clelia Tiziana Storlazzi教授为通讯作者的文章，介绍在急性髓系白血病（AML）中Myc的基因组结构，进化和转录影响[33]。
急性髓性白血病AML基因组通常不稳定存在均质染色区（homogeneously staining regions，HSR）和双微体（double minutes，DMs）等基因扩增区域，本文研究者着重研究了白血病染色体8q24区域发现了MYC双微体扩增区，同时也发现环形RNA circPVT1的异常扩增，表明双微体扩增可引起circRNAs表达异常。作者收集了20例 AML基因组扩增样本，采用illumina的TruSeq捕获试剂盒捕获8q22.3-24.1区域进行RNA-seq检测，考察该区域基因表达情况[33]。
图33 CircPVT1在8q24区域同样异常高表达 （来自[33]）
其他类型肿瘤相关circRNA研究报道
2.2 circRNA与心血管疾病
循环系统在2017年度circRNA研究报道出现爆发式增长，多篇高水平研究论文发表，从国家自然科学基金的受理情况来看，也是仅次于肿瘤学的重要领域方向。
circRNA参与平滑肌α-actin基因表达调控
7月11日，知名杂志Circulation Research在线发表了河北医科大学温进坤教授为通讯作者的文章，介绍发现血管平滑肌细胞中调控α-actin基因表达的通路，其中circRNA circACTA2发挥重要作用[34]。
血管平滑肌细胞（VSMC）在调节血压等方面发挥重要作用，α-actin（α-SMA）是最重要的细胞骨架成分。已知TGF-β1可影响α-SMA表达，但关于α-SMA在分子细胞水平表达调控机制还没有研究清楚。本文作者发现EGF家族成员NRG-1的可溶剪切变体形式NRG-1-ICD可影响α-SMA的表达。进一步的研究表明NRG-1-ICD通过结合到α-SMA的第一内含子上面，募集转录因子IKZF1，促进α-SMA基因来源的circRNA circACTA2的形成，circACTA2通过竞争性结合miR-548f-5p抑制后者对α-SMA的表达抑制作用。在本文的研究结果中表明circACTA2的形成似乎与QKI和ADAR2都有关系，但作者没有对此展开太详细的探讨[34]。
图34 血管平滑肌细胞中circACTA2竞争性结合miR-548f-5p（来自[34]）
circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用
8月31日，著名循环学杂志Circulation在线发表了复旦大学眼耳鼻喉科医院颜标教授与赵晨教授为共同通讯作者的文章，介绍发现circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用[35]。
本文报道发现在糖尿病引起的视网膜血管功能障碍中circHIPK3（hsa_circ_0000284）显著升高，进一步的研究表明circHIPK3可以竞争性结合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p，它们可以通过调控VEGFC、 FZD4和WNT2基因，形成一种全新的调控回路，在糖尿病引起视网膜血管功能障碍中发挥作用[35]。
图35 circHIPK3及相关通路在视网膜血管功能障碍中的作用（来自[35]）
circRNA MFACR竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译
5月12日，Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了青岛大学医学院李培峰教授和中国医学科学院北京阜外医院张宇辉为共同通讯作者的文章，介绍发现环形RNA MFACR通过竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译，进而抑制线粒体分裂并影响细胞凋亡作用，最终在人类心脏疾病中发挥作用[36]。
本文首先发现了心肌梗死（MI）标本中MTP18过表达，又通过预测分析和实验验证，找到miR-652-3p通过结合MTP18的3’UTR序列并进一步证明了miR-652-3p与MI中线粒体分裂和细胞凋亡的关系。miRNA Sponge是环形RNA的重要功能模型，于是作者继续寻找能竞争性结合miR-652-3p的环形RNA，首先基于数据库检索，找出MI特异性变化的环形RNA，然后通过PCR验证，最终发现了MFACR。最后实验结果表明在心肌缺血再灌注模型中MFACR通过竞争性结合抑制了miR-652-3p，而miR-652-3p通过结合MTP18的mRNA并抑制其翻译过程，MTP18蛋白则促进线粒体分裂和细胞凋亡作用，在心肌梗死中发挥重要作用[36]。本文的思路与绝大多数环形RNA研究的思路不同，先是找到了疾病相关的蛋白，然后又找到了对应的调控miRNA分子，最后才预测和鉴定到环形RNA。
图36 MFACR竞争性结合miR-652-3p在心肌梗死中发挥作用（来自[36]）
敲低circRNA有助于提高血管内皮细胞功能
7月8日，Theranostics在线发表了复旦大学眼耳鼻喉医院Yan Biao和南京医科大学第四临床医医院Jiang Qin为共同通讯作者的文章，介绍发现敲低circZNF609可改善血管内皮功能障碍[37]。
血管功能障碍与癌症等多种疾病有关，本文作者发现敲低circRNA-ZNF609可改善血管内皮细胞的功能障碍。在体内模型中，敲低circRNA-ZNF609可降低视网膜血管减少并抑制病理性血管异常。体外实验也表明敲低circRNA-ZNF609可促进血管内皮细胞的功能。机制方面作者发现circRNA-ZNF609可竞争性结合miR-615-5p[37]。
图37 体内模型中干扰circRNA-ZNF609促进血管内皮细胞功能 （来自[37]）
QKI蛋白通过调控circRNAs抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤
11月13日，Circulation Research杂志在线发表了德国汉诺威医学院Shashi Kumar Gupta和Thomas Thum为共同通讯作者的文章，介绍发现QKI5介导的circRNAs形成作用参与抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤[38]。
化疗药物阿霉素处理小鼠心肌细胞的实验模型中，研究者用全转录组高通量测序发现，5个RNA结合蛋白在此过程中发生了差异表达，其中QKI显著下调，响应阿霉素的作用最强烈。敲低QKI蛋白可增加阿霉素处理心肌细胞的凋亡和萎缩，而外源过表达QKI可逆转阿霉素的作用，体内实验同样发现该现象。进一步研究表明QKI5可调控Ttn, Fhod3, and Strn3基因起源的circRNAs分子来实现抑制阿霉素的作用[38]。
图38 QKI5调控circRNA生成抑制阿霉素的作用 （来自[38]）
其他circRNA与心血管疾病相关的研究报道
2.3 circRNA与其他人类疾病
除了肿瘤和心血管疾病，2017年还有许多人类疾病有circRNA的相关研究报道，由于体量巨大，我们只选择有代表性的几篇做简答介绍，后面会附上所有相关的文献的基本信息。
circ-ANXA2可作为多发性硬化症疾病标志物
6月23日，Human Molecular Genetics杂志在线发表了西班牙Biodonostia健康研究所Otaegui, David为通讯作者的文章，介绍在多发性硬化症（multiple sclerosis）中circRNA circ-ANXA2可作为疾病标志物的研究[39]。
多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，本中作者基于芯片分析筛选了疾病相关的circRNAs，共找到了406种表达差异的circRNA。最终发现来源于ANXA2基因的circRNA可作为多发性硬化症的标志物[39]。
图39 circ-ANXA2可作为多发性硬化症的标志物（来自[39]）
circRNA与肝脏脂肪变性的关系
9月5日，Oxidative Medicine and Cellular Longevity杂志在线发表了上海交通大学新华医院范建高主任为通讯作者的文章，介绍发现肝脏脂肪变性中circRNA_0046367的变化情况及分子机制研究[40]。
作者在体外FFA诱导HepG2细胞脂肪性变模型中发现circRNA_0046367低表达，信息学分析及实验验证表明circRNA_0046367可以竞争性结合miR-34a，阻止其与靶分子PPARα的结合。脂肪性变的肝脏细胞中circRNA_0046367表达下降，释放miR-34a分子，进一步抑制PPARα的功能，促进脂肪代谢相关的基因表达，如CPT2，ACBD3等。而脂代谢带来的脂质过氧化作用会损伤线粒体，进而导致疾病。过表达circRNA_0046367能缓解该作用。
图40 circRNA_0046367竞争性结合miR-34a在肝脏脂肪变性中的作用 （来自[40]）
其他circRNA与人类疾病的相关报道
第三章目录
3
circRNA研究工具与方法进展
3.1 circRNA相关数据库
3.2 circRNA相关信息学分析工具
3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展
4
非医学相关circRNA研究进展
4.1 植物学领域circRNA进展
4.2 动物学领域circRNA进展
5
circRNA重要综述
6
circRNA研究总体趋势与未解决问题汇总分析
6.1 circRNA相关国家自然科学基金
6.2 circRNA仍未解决的问题汇总
7
参考文献
3. circRNA研究工具与方法进展
要开展circRNA研究离不开有效的研究方法和工具，经历了多年的发展，已经积累了很多非常有效的研究工具和方法，2017年在circRNA研究工具和方法方面也取得了长足发展，包括相关的数据库工具，信息学分析工具以及生化和分子细胞生物学技术等等，下面分别详述：
3.1 circRNA相关数据库
CSCD：肿瘤特异性circRNA数据库
9月28日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了武汉大学何春江教授和UT health Science Center韩冷教授为共同通讯作者的文章，介绍发布一个全新的肿瘤特异性circRNA数据库：CSCD（cancer-specific circRNA database[41]，网址：http://gb.whu.edu.cn/CSCD）。
CSCD数据库从ENCODE中收集了19种肿瘤类型的87种细胞系及141种正常细胞的circRNA数据，构建了该数据库。总共汇总得到了272152种肿瘤特异性的circRNAs，950962种正常细胞特异的circRNAs，还有170909种为肿瘤和正常样本共有的。共收集了1394023种circRNA分子，其中外显子来源759039种，内含子来源436668种，基因间序列来源122806种。来自mRNA的1153542种，来lncRNA的42165种。预测到了MRE 76439955个，RNA结合蛋白结合位点103927037个，ORF 3462097个[41]。
图41 CSCD数据库概览（来自[41]）
exoRBase：外泌体长链RNA数据库
10月9日，Nucleic Acids Research杂志（IF 2016= 10.16）在线发表了复旦大学医学院上海肿瘤研究所黄胜林教授为通讯作者的文章，公布他们开发的专门收录外泌体中各种长链RNA（mRNA, lncRNA及circRNA）的数据库：exoRBase[42]。数据库连接：http://www.exoRBase.org
exoRBase数据库共收录了58330种circRNAs，15501种lncRNAs，18333种mRNAs，它们来自92份血清外泌体RNA-seq测序样本。作者还依据GTEx project获得组织特异性RNA表达特征，分析了相关RNA分子的组织来源。数据库收录的样本包括健康对照者32例，冠状动脉心脏疾病（CHD）6例，结肠癌（CRC）12例，肝细胞癌（HCC）21例，胰腺腺癌（PAAD）14例，乳腺癌2例[42]。
图42 exoRBase数据库概览（来自[42]）
circlncRNAnet：整合lncRNA和circRNA的功能网络的在线分析数据库
11月29日，Gigascience杂志在线发表了台湾长庚大学医学院Bertrand Chin-Ming Tan为通讯作者的文章，介绍一种整合的circRNA分析数据库：circlncRNAnet[43]。
circlncRNAnet 在线数据库由我国台湾科学家创建的关于lncRNA和circRNA功能研究的数据库，本人试用后发现该数据库非常实用，对科研课题的数据挖掘可以起到事半功倍的作用，是近年来ncRNA领域不可多得的在线友好数据分析工具。总结起来该数据库主要有如下三大优点：用户可提交分析自己的lncRNA和circRNA芯片或测序的表达数据；整合了TCGA数据库20多个肿瘤类型数据，无需编程实现在线可视化分析；分析模块非常丰富，包括lncRNA组织表达热图、箱线图、共表达散点图、circos图，基因功能富集分析GO和KEGG图，还有RBP-RNA结合蛋白网络图，miRNA网络图等[43]。具体网站链接http://app.cgu.edu.tw/circlnc/
图43 CirclncRNAnet数据库设计及分析流程示意图 （来自[43]）
3.2 circRNA相关信息学分析工具
circRNA检测工具系统评价
6月8日，PLoS Computational Biology杂志在线发表了天津大学计算机科学与技术学院邹权教授为通讯作者的综述文章，汇总和比较了目前主要的circRNA分析相关技术的优势与不足[44]。
文中比较了目前已报道的常用的分析circRNA的11种工具，比较了它们在精度，灵敏度，F1 Score，AUC值（Area under Precision-Recall Curve），运行时间及物理存储空间需求等指标的情况，没有一种工具是所有指标都表现的异常出色的[44]。换言之，这11种分析方法表现为各有所长，在具体应用的时候还是需要根据需求灵活选择最合适的工具。最终作者认为CIRI、CIRCexplorer和KNIFE的各方面性能得到了最大程度的平衡是常规环形RNＡ分析工具的首选[44]。
图44 各种circRNA分析工具（来自[44]）
circRNA二级结构预测算法
2月20日，Journal of Theoretical Biology杂志在线发表了西班牙萨拉戈萨生物计算和物理复杂系统研究所Jose A. Cuesta为通讯作者的文章，介绍分析circRNA二级结构的研究工作[45]。与所对应的线性RNA不同，circRNA存在拓扑张力的问题，且不存在线性RNA那样的预测起点（circRNA的每个碱基都是等效的），因此circRNA的二级结构分析预测的方法与线性RNA有所差别，本文对circRNA二级结构预测算法做了分析。
circScan分析circRNA相互作用蛋白
3月11日， 著名预印本杂志BioRxiv在线发表了中山大学屈良鹄教授和杨建华教授为共同通讯作者的文章。介绍利用circScan分析circRNA相互作用蛋白的技术[46]。
作者开发了一种全新的分析circRNA相互作用蛋白的技术体系，称为circScan，主要是基于交联技术将互作蛋白钓取的RNA进行深度测序（CLIP-Seq），找出包含反向拼接的Reads。利用该技术流程，作者在人的样品中发现了12540种circRNA-蛋白相互作用，小鼠中发现了1090种。有趣的是，作者发现了一些circRNA与eIF3相互作用，这是一种5’-帽子不依赖的蛋白翻译起始因子，也发现了circRNA具有m6A修饰的情况[46]。这与其他文献报道的发现吻合。
图45 circScan流程分析蛋白-circRNA相互作用（来自[46]）
其他circRNA相关分析工具方法报道
3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展
Cas9同源蛋白Csy4促进circRNA生成
2月21日，RNA杂志在线发表了北卡大学教堂山分校Aravind Asokan教授为通讯作者的文章，介绍开发了一种基于CRISPR同源蛋白Csy4的促进RNA环化的技术[47]。
Csy4是CRISPR家族的一个Cas-9的同源蛋白，有时也被称为Cas6f具有核酸内切酶的功能，在将RNA分子切割后可使5’端切割后的产物更稳定。基于这一特性，作者设计了一种表达circRNA的体系，概括而言，就是在内含子中插入Csy4的识别序列，共表达Csy4后该序列下游的RNA序列被切割后降解掉，上游的序列得以稳定存在，促进了环化效率。该方法或许有助于提高circRNA表达的效率和特异性，减少线性RNA副产物。值得引入circRNA过表达体系中[47]。
图46 Csy4可以结合在RNA3’端并稳定RNA分子，促进circRNA的生成（来自[47]）
circRNA制备新技术体系
4月11日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了NIH 的Amaresh C. Panda和Kotb Abdelmohsen为共同通讯作者的文章，介绍开发了一种提高circRNA获得效率的新技术[48]。
作者报道的该技术体系在常规的RNase R消化的基础上增加了去除Poly(A)的操作，可大大提高去除线性RNA的效率，作者将该技术称为（RNase R treatment followed by Polyadenylation and poly(A)+ RNA Depletion，RPAD）。基于该技术，作者发现了大量新的内含子来源的circRNA[48]。
图47 RPAD技术流程（来自[48]）
基于tRNA的circRNA表达体系
4月13日，RNA Biology杂志在线发表了北卡罗莱纳大学教堂山分校A. Gregory Matera教授为通讯作者的综述文章，介绍一种基于tRNA剪接作用的circRNA表达策略[49]。
去年A. Gregory Matera教授就曾在酶学方法杂志发表过改技术方法的文章。本文主要分析了古生物和动物中tRNA内含子来源的circRNA，以及借助该体系开发circRNA表达系统[49]。
图48 两种不同的体内circRNA表达系统（来自[49]）
诱导表达circRNA体系
8月2日，方法学杂志Methods in Molecular Biology发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Deirdre C. Tatomer、Dongming Liang和Jeremy E. Wilusz撰写的方法学文章，介绍一种可诱导表达的circRNA体系[50]。大致设计思路是将要表达的circRNA序列克隆至包含反向互补序列的表达载体中，两侧为内含子序列。该RNA分子是诱导表达的，在加入诱导剂后可自动转录产生线性RNA初产物，后由两侧的反向互补序列介导环化作用。
定量蛋白组学分析肝细胞癌中CDR1as的作用网络
9月11日，Journal of Proteome Research杂志（IF 2016=4.268）在线发表了中科院武汉水生生物所葛峰教授为通讯作者的文章，介绍在HCC细胞系中过表达CDR1as后定量蛋白质组学分析[51]。
作者在HepG2细胞中过表达CDR1as，然后进行定量蛋白质组学分析，共测到330种差异表达蛋白（DEPs），通路分析表明大部分与细胞增殖和周期调控有关。也佐证了CDR1as对miR-7的调控作用，例如EGFR是miR-7的下游分子，过表达CDR1as后EGFR出现上调。本文首次利用定量蛋白质组学分析过表达circRNA后细胞变化情况，值得借鉴。
图49 定量蛋白质组学分析CDR1as过表达后蛋白变化 （来自[51]）
circRNA-蛋白相互作用研究进展
9月26日，Theranostics杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的综述文章，系统汇总了截至目前circRNA与蛋白相互作用的研究进展[52]。文中作者系统分析回顾了circRNA-蛋白相互作用的研究进展，主要研究技术及这种相互作用的生理意义。circRNA-蛋白相互作用会对彼此都产生一定的影响，circRNA的存在可以调控蛋白的定位等状态，蛋白与circRNA的结合也会影响circRNA的生成等过程。这初步说明circRNA-蛋白相互作用是非常重要的细胞调控机制，目前的研究还处于早期，非常值得深入探索。
基于数字PCR进行circRNA的绝对定量分析
2017年共有两篇文章报道基于微滴式数字PCR进行circRNA绝对定量的分析研究。其中一篇是宁波大学医学院郭俊明教授于11月2日在线发表于Journal of Molecular Medicine杂志的文章，介绍基于微滴式数字PCR分析胃癌血浆中circRNA的测定[53]。
微滴式数字PCR（ddPCR）是最近兴起的可绝对定量的PCR技术，本文作者首次将微滴式数字PCR应用于circRNA的绝对定量。作者利用ddPCR分析了胃癌患者血液中circRNA的变化情况，通过与疾病特征的相关性分析，最终表明Hsa_circ_0001017和 hsa_circ_0061276可以作为胃癌有效的诊断标志物[53]。
图50 ddPCR检测circRNA （来自[53]）
另一篇是第二军医大学附属长海医院Qing Jing于11月7日在线发表于Biotechnology & Biotechnological Equipmen杂志的文章[54]。
circRNA在单细胞间表达的异质性
10月31日，Scientific Reports在线发表了华中科技大学宁康为通讯作者的文章，介绍基于单细胞测序，分析了细胞之间circRNA的异质性表达特征[55]。作者利用单细胞测序的方法分析了HEK293不同细胞之间circRNA的表达差异情况，结果表明细胞之间circRNA的表达存在一定程度的异质性。
uvCLAP用于circRNA蛋白相互作用分析
7月1日，预印本杂志BioRxiv在线发表了德国弗莱堡弗赖堡大学计算机科学系生物信息学组Rolf Backofen和马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar为共同通讯作者的文章，介绍基于uvCLAP分析蛋白与RNA相互作用的技术，其中包括了circRNA的分析[56]。
4. 非医学相关circRNA研究进展
除了医学方向，2017年在非医学方向circRNA的报道也出现一定程度增长态势，主要分为植物学和动物学两个领域。
4.1 植物学领域circRNA进展
拟南芥中发现circRNA调控RNA剪接作用
4月18日，Nature Plants杂志在线发表了法国格勒诺布尔-阿尔卑斯大学Simon J. Conn教授为通讯作者的文章，介绍在拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因来源的circRNA形成R-loop调控同源mRNA的剪接过程[57]。
本中作者探索了拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因第六外显子形成的circRNA对所对应的同源mRNA剪接作用的影响，该circRNA能够稳定结合所对应的DNA序列，形成RNA:DNA杂交体，导致转录暂停，募集RNA拼接因子，形成可变剪切[57]。
图51 SEP3基因第六外显子形成的circRNA调控RNA拼接过程（来自[57]）
植物类病毒突变率分析
9月14日，PLoS Pathogens杂志在线发表了西班牙瓦伦西亚大学Rafael SanjuaÂn为通讯作者的文章，介绍基于高保真深度测序分析叶绿体与核中类病毒的自发突变率[58]。类病毒基因组为单链环形RNA分子，本文作者挑选了两种类病毒进行分析，一种是定位于叶绿体的简写为ELVd的类病毒，另一个是定位于细胞核的简写为PSTVd的类病毒。结果表明ELVd的突变率高于PSTVd。
其他植物学相关circRNA研究报道
4.2 动物学领域circRNA进展
小鼠中风模型中circRNA表达特征分析
7月12日，Stroke杂志在线发表了威斯康星大学麦迪逊分校Raghu Vemuganti教授为通讯作者的文章，介绍在小鼠缺氧中风模型中伴随时间变化，circRNA表达特征的研究工作[59]。
作者在基于大脑中动脉栓塞构建的小鼠中风模型中分析了6，12和24小时后半暗带皮质中circRNA的表达特征。实验基于芯片法分析，共获得了1320多种circRNA，其中1064种来源于外显子。283种在至少一个时间点表现出差异表达，16种在三个时间点都有同样趋势的变化[59]。本文是首次探索中风模型中circRNA的变化情况，从实验结果来看，circRNA的表达明显受到生理或病理刺激因素的影响。但美中不足的是，本文是基于芯片法分析的，并未针对各种circRNA所对应的线性RNA产物和转录本的表达变化进行分析，如果能找出伴随中风症状而特异性改变的circRNA或许更有意思。
图52 小鼠中风模型中circRNA差异表达分析（来自[59]）
牛成肌细胞分化相关circRNA研究
10月26日，Cell Death & Disease杂志在线发表了西北农林科技大学陈宏教授为通讯作者的文章，介绍发现circLMO7参与调控牛的成肌细胞分化作用[60]。
作者挑选了胎牛和成年牛的肌肉组织进行RNA-Seq分析，共得到了12981种circRNA分子，其中还有530种为携带内含子的circRNA（ciRNA）。作者也针对所得到的circRNA分子进行了基因组定位，分子大小，包含的外显子情况等参数进行了汇总比较。相对于胎牛肌肉组织，circLMO7是下调最明显的circRNA分子之一。作者针对该分子做了一系列的生信分析和相关实验分析。
图53 牛成肌分化中circRNA变化情况 （来自[60]）
其他动物学相关circRNA报道
5. circRNA重要综述
随着circRNA研究的不断深入，circRNA相关的综述文章也呈现递增趋势，2017年也有多篇重量级的综述文章发表，包括Nature Review Neuroscience杂志等等。
Nature Review Neuroscience：非编码RNA在神经退行性疾病中的作用
8月7日，Nature Review Neuroscience杂志在线发表了比利时VIB脑病研究中心Evgenia Salta和Bart De Strooper共同撰写的综述文章，系统汇总了神经退行性疾病中非编码RNA的作用研究进展。其中有较大的篇幅论述了circRNA在神经退行性疾病中的研究情况[61]。主要包括CDR1as竞争性结合miR-7与神经系统的关系，circ-ANRIL在AD疾病表观遗传方面的作用等。
Nature Immunology：LncRNA与免疫信号通路的关系
8月21日，Nature子刊 Nature Immunology在线发表了斯坦福大学医学院Howard Y Chang教授为通讯作者的文章，系统汇总了lncRNA与免疫信号的关系研究进展，其中较大的篇幅涉及到了circRNA[62]。其中包括circRNA竞争性结合miRNA的作用机制，circRNA参与调控基因转录等作用机制与免疫信号的关系，还特别提到了Howard Y Chang教授今年6月15日在Molecular Cell杂志发表过的外源表达circRNA促进细胞免疫信号激活的文章[63]。
Theranostics：circRNA与肿瘤关系
7月22日，Theranostics在线发表了昆明医科大学附属第三医院杨祚璋和谢琳为共同通讯作者的综述文章，汇总了circRNA与肿瘤的关系研究进展[64]。文中较系统的汇总了circRNA形成机制，在不同肿瘤中的研究进展以及作为肿瘤标志物的研究进展。
肿瘤中可变剪切综述
9月14日，Seminars in Cell & Developmental Biology杂志（IF 2016=6.614）在线发表了中科院计算生物学研究所王泽峰教授与Song Xiaowei为共同通讯作者的综述文章，汇总介绍了肿瘤中可变剪切与肿瘤机制的关系及在肿瘤治疗中可能的价值[65]。
Oncogene发表重要circRNA综述
10月9日，Oncogene杂志（IF 2016= 7.519）在线发表了丹麦奥胡斯大学Lasse Sommer Kristensen 教授为通讯作者的综述文章，著名RNA研究专家Jørgen Kjems教授也是本文的共同作者之一[66]。
本文中作者系统汇总了目前关于circRNA研究的主要进展，重点汇总了circRNA作为肿瘤标志物的进展，还针对circRNA的功能研究，将可能具有抑癌基因特征和癌基因特征的circRNA分子进行了简单的分类。关于今后circRNA研究需要解决的问题，文章给出了非常中肯的建议，其中包括circRNA的标准化命名问题，肿瘤特异性circRNA表达特征形成的机制，circRNA的修饰等问题。提高RNA-seq的样品制备质量和分析精度也是需要继续改进的方向。
图54 可作为肿瘤标志物的circRNA分子 （来自[66]）
自噬相关非编码RNA综述
4月25日，知名杂志Autophagy在线发表了哈尔滨医科大学肿瘤医院Xu Shouping和Pang Da为共同通讯作者的综述文章，系统汇总了自噬过程中非编码RNA的作用[67]。
本中系统汇总了与自噬过程有关的非编码RNA研究进展，包括lncRNA，miRNA以及circRNA。在此基础上基于信息学的通路分析和进化分析，形成了与自噬有关的非编码RNA作用网络[67]。
图55 不同物种自噬相关miRNA等非编码RNA作用网络（来自[67]）
其他circRNA相关综述列表
6. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析
6.1 circRNA相关国家自然科学基金
circRNA研究领域在2017年获批项目情况有了巨大的飞跃，经严格统计汇总，2017年国家自然科学金获批的项目中circRNA研究相关的项目总数高达176项，其中包括了两项杰出青年基金，一项优秀青年基金，两项重点项目，94项面上项目，62项青年基金项目，15项地区科学基金项目。
从2017年获批的circRNA项目可以总结出目前circRNA研究的总体特征：
（1）肿瘤学和循环系统方向是目前circRNA研究最好活跃的学科方向。
（2）circRNA研究已实现从转录组学筛选向特定功能性circRNA机制研究的转变。
（3）circRNA与microRNA相互作用关系是目前最常见的circRNA功能研究思路，未来其他circRNA功能模型的探索会越来越受到重视。
（4）circRNA如何发挥生物学功能的基础研究仍面临不小的挑战，探索开发有效的分析RNA与其它分子相互作用研究工具是打破circRNA功能研究瓶颈的关键。
6.2 circRNA仍未解决的问题汇总
刚刚结束的2017年是不平凡的一年，circRNA在这一年里取得了非常大的进展，一些科学假设被逐渐证实，包括circRNA可直接翻译多肽，circRNA存在m6A修饰等等。但科学问题具有迭代的特征，旧问题解决之后一定会伴随产生新的问题，总结而言，circRNA依然面临如下基本问题：
（1）circRNA与所在基因的互作机制是怎样的？转录水平，转录后水平等不同层次的相互关系是怎样的？
（2）除了m6A，其他修饰类型是否也可存在于circRNA中？这些修饰的生理病理机制是怎样的？
（3）circRNA的二级结构与功能的关系是怎样的？
（4）circRNA的翻译效率往往低于liner RNA，这是自然选择的结果？还是仍在进化的机制？为什么ciRS-7，SRY等基因会选择主要以环形RNA的形式存在？
（5）竞争性结合miRNA是最容易入手的机制研究模型，但如何更严谨的证明circRNA与miRNA的相互作用还需要进一步完善。
（6）circRNA进入外泌体可能存在在选择性，机制和生理病理意义是什么？
（7）circRNA亚细胞定位的机制是怎样的？
（8）组织/疾病特异性circRNA表达特征是如何形成的？会有多少种机制调控circRNA的形成？
（9）能否实现circRNA的超高分辨率光学成像，活细胞成像或动物体内成像？以更接近生理状态的条件下分析其分布和功能。
（10）人群基因组中经常出现SNP多态性或高度相关的基因区，这些位点或区域与circRNA的关系是怎样的？是否通过circRNA相关的机制发挥作用？
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