今天跟大家分享的是最近发表在Molecular Therapy-Oncolytics上的一篇文章,影响因子7.2。
Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma
单细胞 RNA 测序分析确定了黑色素瘤中 CD8+T 细胞亚群的异质性和新的治疗靶点
小仙女 doi: 10.1016/j.omto.2020.12.003 Molecular Therapy-Oncolytics(IF=7.2)2021/7/4
首先让我们通过摘要了解下这篇文章的主要内容,CD8+ T 细胞在抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用,它们的高浸润性与良好预后相关。然而,肿瘤微环境中的CD8+T细胞亚群可能在预后、进展和免疫治疗中发挥不同的作用。在这篇文章中,作者分析了先前发表的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 黑色素瘤数据来探索 CD8 + T 细胞亚群的异质性,确定了 7 个主要亚群并描述了不同亚群中免疫检查点的动态转录图谱,最后确定了不仅免疫抑制检查点的基因而且 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 都可以作为黑色素瘤治疗的潜在靶点。
一. 材料和方法
1.1 scRNA-seq 和 RNA-seq 数据
scRNA-seq数据(Smart-seq data, GEO: GSE120575 and 10x Genomics data, GEO: GSE139829),T细胞的scRNA-seq数据(Smart-seq data, GEO: GSE72056),从 TCGA 和 GTEx 数据库下载了 471 个皮肤黑色素瘤和 1,809 个正常样本的 RNA-seq 数据。
1.2 细胞亚群识别
作者使用了 48 个 smart-seq 和 11 个 10x Genomics 黑色素瘤样本来进行 CD8 + T 细胞分析。使用Seurat 包进行标准化处理,应用 PCA 和 Find Clusters来识别细胞簇。作者分别从 Smart-seq 和 10x Genomics 中分离了 3,525 和 7,336 个 CD8 + T 细胞,应用Harmony 算法整合了这两个平台的总共 10,861 个 CD8 + T 细胞。最后识别了7 个 CD8 + T 细胞亚群并根据先前报道的标记基因注释了幼稚/记忆 CD8 + T 细胞,细胞毒性 CD8 + T 细胞和耗竭的CD8 + T细胞。
1.3 Bulk RNA-seq 中 CD8 + T 细胞亚群的细胞成分
应用CIBERSORT算法来识别Bulk RNA-seq数据中CD8 + T 细胞亚群的细胞成分。作者将 TCGA 肿瘤样本分为两个亚组:高比例 CD8 + T 细胞亚群和低比例 CD8 + T 细胞亚群来探讨CD8 + T 细胞亚群与黑色素瘤患者预后之间的关系。作者还根据TCGA的信息将肿瘤样本分为四个病理阶段并在不同病理阶段鉴定CD8 + T细胞亚群的动态变化。此外,作者应用 ggstatsplot包分析了正常和肿瘤样本之间浸润细胞亚群的差异比例。
1.4 通路活性分析
在这一部分,作者进行了 GO 分析、KEGG 分析和 GSEA分析,以阐明单细胞水平不同临床结果的机制。作者对亚群的通路活性进行了评分,进行缺氧与其他通路之间的Pearson相关分析,以确定缺氧的影响。
1.5 伪时间轨迹、细胞间相互作用和单细胞调控网络分析
作者应用slingshot包对所有CD8 + T 细胞亚群进行轨迹分析,将初始/记忆亚群设置为起始亚群。随后作者分析了幼稚/记忆亚群分化为疲惫亚群的过程中细胞毒性和检查点分子的表达水平。应用CellphoneDB研究细胞与细胞的相互作用。此外,使用SCIENIC包计算细胞亚群的基因调控网络。
1.6 新靶点分析
在这一部分,作者应用 Kaplan-Meier 生存分析来分析耗竭 CD8 + T 细胞亚群 2 中过表达的基因并通过ggstatsplot 包来验证筛选靶标的表达水平。随后,作者从FIREBROWSE 数据库中分离了2,043 个 T 细胞来验证新靶标。
二. 结果展示
2.1 识别黑色素瘤中的 CD8 + T 细胞亚群
作者首先基于所有基因表达水平的 t 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 分别在 smart-seq 和 10x Genomics 数据中识别亚群(图1)。在 smart-seq 数据中识别出 12 个簇,而 10x Genomics 数据中识别出25个簇。然后,通过可视化 CD8 + T 细胞特征来识别特定细胞簇的不同表达程度。对于smart-seq数据,CD8A 和CD8B 主要在簇0中高表达。然而,10x Genomics 数据对cluster6、cluster8、cluster12、cluster 16 和 cluster 17具有特异性。随后,作者将这些 CD8+T 细胞簇通过 Seurat 包的内置算法从两个平台中分离出来,并使用 Harmony 算法进行整合,分离出 10,861 个 CD8 + T 细胞进行后续的分析。将这些 CD8 + T 细胞聚集成 7 个亚群并使用先前报道的细胞标记进行注释。最终,确定了四个细胞毒性亚群、两个耗竭的亚群和一个幼稚/记忆亚群。每个亚群中的细胞比例显示,细胞毒性亚群 4、幼稚/记忆亚群、耗竭亚群 2 和细胞毒性亚群3是黑色素瘤 TME 中最常见的细胞亚群。
2.2 CD8 + T 细胞亚群与预后相关
在这一部分,作者从scRNA-seq数据中提取特征基因,并利用这些矩阵对471例SKCM和1809例正常RNA-seq样本进行去卷积得到SKCM和正常样本中CD8 + T细胞亚群细胞成分(图2)。SKCM 样本包含幼稚/记忆、细胞毒性亚群 2、细胞毒性亚群 3、耗竭的亚群 1 和耗竭的亚群 2这几种细胞亚群并且耗竭的亚群 2 占 CD8 + T 细胞的最大比例。接下来,作者进行了 Kaplan-Meier 生存分析来表征这些亚群的预后作用。作者发现高比例的幼稚/记忆和细胞毒性亚群 3 与良好的预后相关而耗竭的亚群2可能导致不良的预后。然后,作者探索了细胞毒性亚群 3 和耗竭亚群 2 在不同病理阶段的动态变化。结果表明细胞毒性亚群 3 的比例随着肿瘤进展而减少。相比之下,耗竭的亚群2的比例随着肿瘤进展而增加,II 期比例最高。
2.3 异质通路活性的景观
为了探索通路是否在不同的 CD8 + T 细胞亚群中存在异质性,作者进行了GO分析、 KEGG分析、GSEA和通路活性分析(图3)。GO 分析显示,耗竭的亚群 2 具有独特的生物学过程,并且在该亚群中富集的生物学过程很少。幼稚/记忆和细胞毒性亚群 3 具有相似的生物学过程。然而,KEGG 分析结果显示了每个 CD8 + T 细胞中相当大的异质性。然后作者使用代谢基因集对所有细胞亚群进行评分发现耗竭的亚群 1 具有最显著的代谢通路活性。组氨酸代谢和酪氨酸代谢在耗竭的亚群 2 中显著上调,耗竭的亚群1具有最高的通路活性。GSEA 分析结果显示,氧化磷酸化和糖酵解/糖异生在耗竭的亚群 1 中显示出高度上调的活性,与通路活性分析一致。在细胞毒性亚群 3 中观察到氧化磷酸化和 TCA 循环的上调。
为了进一步表征不同亚群的异质性,作者还采用了标志基因集、PD-1 和 CTLA-4 信号通路来进行通路活性和 GSEA 分析。与上述代谢分析类似,几乎所有标志性通路在耗竭的亚群 1 中普遍上调(图 4)。作者还发现免疫检查点通路、PD-1 和 CTLA-4 信号通路在每个细胞亚群中都被上调。重要的是,免疫检查点通路的最高活性主要集中在细胞毒性亚群 2、细胞毒性亚群 3、耗竭的亚群 1 和耗竭的亚群 2。这些结果表明,阻断免疫检查点可能有助于促进 CD8 + T 细胞的抗肿瘤免疫反应。
2.4 伪时间轨迹揭示免疫检查点的动态变化
在这一部分,作者进行了伪时间轨迹来探索 CD8 + T 细胞的分化程序是否会影响预后。作者在 CD8 + T 细胞分化过程中发现以下轨迹:幼稚/记忆 CD8 + T 细胞倾向于转化为衰竭亚群 2(谱系 1)或细胞毒性亚群 1(谱系 2)(图 5)。在谱系 1 程序中,细胞毒性特征将在幼稚/记忆 CD8 + T 细胞分化为细胞毒性亚群 3 的过程中上调,然后这些特征趋于下调,直到在耗竭的亚群2中表达量最低。在免疫检查点(PDCD1、TIM-3/HAVCR2和LAG3)和共刺激分子(CD27)中观察到类似的趋势。然而,耗竭特征(CTLA4、TIGIT和TNFRSF9)和协同检查点CD7呈上升趋势。这些结果表明了黑色素瘤中CD8+T细胞的伪时间轨迹和免疫检查点的时间依赖性变化。
2.5 CD8 + T 细胞亚群中的异质相互作用对和转录因子
由于不同CD8+T细胞亚群的异质性,作者分析了它们的通讯网络,以确定主导相互作用的关键配体-受体对和细胞亚群。结果显示耗竭的 CD8 + T 细胞亚群 1 在相互作用对中起主导作用(图 6)。在不同的 CD8 + T 细胞亚群中,有 83 个重要的配体-受体对。其中,最常见的 5 个配体-受体对是 CCL5_CCR5、CD74_MIF、CD74_COPA、CCL4_CCR5 和 HLA_E_KLRK1。先前报道的一项研究已经确定转录因子 (TF) 可以塑造 T 细胞表型并调节基因表达。因此作者采用 SCENIC 来探索 CD8 + T 细胞亚群中潜在的差异化 TF。结果显示TF 在特定亚群中表达,例如 KLF6、FOS、FOSB、JUNB 和 CREM 在幼稚/记忆亚群中的高表达。总的来说,这些分析确定了耗竭的 CD8 + T 细胞亚群 1为主要亚群、频繁的配体-受体对以及 CD8 + T 细胞亚群的 TF 的差异调节。
2.6 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 是新的治疗靶点
由于高比例的衰竭亚群2导致SKCM预后不良,作者分析了该亚群中高表达的基因,以筛选出潜在的治疗靶点(图7)。通过 Kaplan-Meier 生存分析以筛选出 PMEL、TYRP1 和 EDNRB可能为新靶点,这些基因的高表达与 SKCM 的不良预后显著相关。此外,这三个基因在 SKCM 的Bulk RNA-seq 样本中也显示出高表达。作者还探讨了PMEL、TYRP1 和 EDNRB 是否会在不同的病理阶段动态表达,发现只有TYRP1可能参与SKCM进展。接下来,作者通过 FIREBROWSE 数据库研究了不同肿瘤中新靶点的转录水平。这些新靶点在SKCM和UVM中变异最显著,这说明了新靶点与黑色素瘤的联系紧密。总之,该部分结果表明与黑色素瘤密切相关的 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 会导致不良的临床结果,并可能作为新的治疗靶点。
好啦~这篇文章的内容就这么多啦~总之,本研究基于黑色素瘤 scRNA-seq 数据表征了不同 CD8+T 细胞亚群之间的异质性。这些分析使我们能够了解黑色素瘤 TME 中不同 CD8 + T 细胞亚群的异质功能。最重要的是,本研究确定了 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 可以作为黑色素瘤的潜在治疗靶点。