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关于癌症与免疫相关的生物信息学套路，大家已经耳熟能详，那么我们接下来先详细全面具体的总结一下肿瘤组织中的免疫微环境。
肿瘤组织不是单纯的只包含肿瘤细胞，它是由各种不同类型的细胞组成的，其中就包含基质细胞，成纤维细胞，还有免疫细胞等，甚至还有与微生物之间的相互作用，这些就构成了肿瘤的微环境。
肿瘤微环境（Tumor microenvironment）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质（ECM）。
肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。肿瘤微环境中常见的免疫细胞特性包含以下三者：
(1)具有细胞毒杀功能的自然杀手细胞、细胞毒性T细胞数量减少；
(2)具有免疫抑制功能的骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)及调节T细胞数量增加；
(3)巨噬细胞及嗜中性球分别由具促发炎能力的M1及N1表型，转变为具抑制免疫反应而能促进肿瘤生长的M2及N2表型；肿瘤微环境有助于肿瘤异质性的形成。
肿瘤微生物微环境的作用机制
许多研究已经观察到肿瘤内微生物与肿瘤微环境之间的相关性。近年来的研究表明，肿瘤微生物作用于肿瘤微环境有多种机制，包括:
1. 癌细胞和免疫细胞存在细菌多肽；
2. 细菌抗原模仿肿瘤抗原；
3. 微生物诱导免疫原性细胞死亡；
4. 辅助模式识别受体介导的信号通路；
5. 微生物衍生的代谢物；
6. 刺激抑制检查点。
免疫检查点抑制剂（ICIs）
检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）治疗是目前最常用的免疫治疗方案，已被批准用于黑色素瘤、肾癌、头颈癌、膀胱癌等多种肿瘤的临床治疗，在肺癌治疗中更是取得突破性进展，成为肺癌综合治疗的新支柱。但由于肿瘤的异质性及肿瘤微环境的复杂性，ICIs单药在非选择患者中有效率偏低。手术、化疗、放疗、靶向治疗等治疗手段可与免疫治疗产生协同作用，联合疗法成为目前探索的热点。
免疫检查点作为免疫抑制性通路，对于维持自身免疫耐受和调节外周组织免疫反应的持续时间和范围至关重要。但这些通路可被肿瘤“劫持”并持续激活，抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤的发生。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA4）、程序性细胞死亡1（programmed death-1, PD-1）及其配体（PD-L1）是目前应用最为广泛的免疫检查点抑制剂靶点，pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab、durvalumab和avelumab在内的PD-1/PD-L1抑制剂及CTLA-4抑制剂ipilimumab已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准用于多种肿瘤的临床治疗，但由于肿瘤的异质性及肿瘤微环境的复杂性，免疫检查点抑制剂治疗的总体有效率较低。手术、化疗、放疗、靶向治疗等治疗手段可与免疫治疗产生协同作用，增强疗效，肿瘤联合治疗策略也是肿瘤治疗的未来方向。
肿瘤免疫微环境在肿瘤常规治疗效应中的作用
由恶变的肿瘤细胞发展成为临床可见肿瘤的过程，实际上是肿瘤细胞与机体相互作用的过程。在这一过程中，肿瘤细胞必须克服机体免疫系统对其的识别和杀伤，逐步建立起强大的免疫抑制网络，同时还需要能为其提供充足营养和适合其快速生长的肿瘤微环境。肿瘤生物学家倾向于把肿瘤组织看作一个特殊的器官。在肿瘤组织中，恶性肿瘤细胞除了被脉管系统缠绕外，还被成纤维细胞、免疫细胞、髓源抑制性细胞等肿瘤基质细胞，以及包括各种功能性分子在内的细胞外基质所包围。肿瘤微环境是动态的，随着肿瘤的发生、发展以及治疗干预而发生变化，同时具有显著的异质性。
肿瘤治疗传统上着眼于肿瘤细胞本身，在进行肿瘤手术切除、化疗、放疗以及靶向治疗和免疫治疗时，都是瞄准快速增殖的恶性肿瘤细胞进行攻击和杀伤，而对机体内在的抗肿瘤免疫反应在肿瘤治疗效应中的作用缺乏认识，同时还忽略了这些治疗对机体抗肿瘤免疫反应的影响，尤其是这种影响对于肿瘤治疗效应和肿瘤发展、转归的意义。近几年，在肿瘤治疗的免疫机制和对肿瘤免疫微环境在肿瘤治疗效应中的作用积累了一定的认识和思考，本文将对此进行梳理和总结，希望能为有效提高抗肿瘤的治疗效应、发展新的肿瘤治疗策略提供有益的思路和参考。
肿瘤免疫抑制微环境的建立
机体的免疫监视机制能够识别肿瘤细胞，有效地清除或者控制肿瘤细胞的生长，维持机体长期处于无瘤状态，但是，还是有相当数量免疫系统健康的个体发生了恶性生长的肿瘤。大量研究发现，肿瘤细胞在与机体免疫系统相互作用过程中，除了通过不断发生突变，产生新的肿瘤细胞变种来逃避机体免疫的攻击外，还会获得对免疫监视的抗性，甚至是 对机体抗肿瘤免疫反应的抑制能力，从而不受限制 地快速扩增，以至最终发生临床可见的肿瘤。大量 临床证据显示: 临床肿瘤组织处于免疫抑制环境，浸润的免疫效应细胞表现为不同程度的免疫功能低 下，甚至是严重缺陷。大量研究结果表明，肿瘤细胞 几乎可以利用免疫系统自身的所有负调控机制，建立起肿瘤微环境的免疫抑制网络。概括起来主要包括以下几种途径:
1. 下调免疫细胞对肿瘤细 胞的识别能力。肿瘤细胞下调肿瘤抗原和MHC I类分子的表达，缺失抗原提呈途径组成成分( TAP1、LMP2和LMP7) 的表达，从而降低CTL对肿瘤细胞 的识别; 脱落 NKG2D 配体在肿瘤细胞表面的表达，减少和阻断 NK 细胞对肿瘤细胞的识别和攻击。
2. 高表达免疫抑制分子。高表达抑制性共刺激分子B7-H1( PD-L1) 等，与T细胞上的抑制性受体结合，抑制T细胞的反应和功能，导致T细胞耐受或功能衰竭; 还有一些肿瘤细胞表面 Fas 表达水平低下，却高表达FasL，并与免疫细胞表面的 Fas 结合，激活免疫细胞的凋亡信号途径，从而损伤机体的抗肿瘤免疫效应。
3. 分泌多种免疫抑制分子，如分泌 TGF-β、IL-10、IDO、VEGF，通过直接或间接的方 式，抑制肿瘤抗原提呈，以及T细胞的活化、增殖、分化和效应功能; 表达可溶性 TNF 结合蛋白，阻断TNF对肿瘤细胞的杀伤作用。
4. 诱导免疫抑制细胞分化、增殖以及向肿瘤部位聚集，主要包括调节性T细胞( regulatory T cell，Treg) 、MDSC 以及 M2 型肿瘤相关巨噬细胞 ( tumor associated macrophage，TAM) 等。已知 Treg 通过多种直接或间接的机制抑制T细胞的反应和功能，对维持机体免疫稳态( homeostasis) 具有非常重要的作用，删除小鼠体内Treg会引起自身免疫病。针对各种肿瘤的大量研究 显示，肿瘤患者的外周血、肿瘤组织以及引流淋巴结中 Treg 细胞的数量和比例均有不同程度上升，以肿瘤组织最为显著，而且Treg数量和功能与肿瘤患者的病程和预后相关。在正常人，MDSC 只占外 周血单个核细胞的1% ，而在肿瘤患者体内则增加 4 ～ 10倍，随着肿瘤的发展会大量聚集在肿瘤部位。MDSC 既可抑制NK细胞和NKT细胞的细胞毒作用，也可抑制CD4 + 和CD8 + T细胞的反应和功能。TAM是肿瘤组织浸润炎症细胞的主要成分，主要表型为M2型，具有促进肿瘤生长、转移、血管生成和免疫抑制的作用。
研究人员比较关注的是免疫细胞在这微环境中的作用。免疫细胞又包括很多种，如 B 细胞，T 细胞等。不同的免疫细胞在肿瘤发生过程中发挥不同的作用，而不同肿瘤的免疫细胞组成也各有特点。是癌症研究中的一个热门方向，
细胞杀伤T细胞通常可以识别癌细胞或被病原体感染的细胞，正因如此，研究人员才能够活到成年。但是，整日召唤过度活跃的免疫细胞到肿瘤细胞或是感染部位，就会导致细胞衰竭疲惫，以至于它们无法再被分配到“入侵者”身边。
幸运的是，癌症专家们已经在研发有效的免疫治疗手段，来对抗免疫细胞衰竭，使免疫细胞重新激发活性消灭病人肿瘤。
那么什么是T细胞衰竭呢？
由于长期暴露于持续性抗原或慢性炎症，疲惫的T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。不过这种耗竭是可以逆转的，至少部分逆转，主要是通过阻止PD-1之类的抑制性通路。
T 细胞耗竭概念急性感染和疫苗接种后，初始T细胞被抗原、共刺激和炎症激活，以指数方式增殖向效应 T 细胞（effector T cell）和记忆 T 细胞（memory T cell）分化。慢性感染和癌症病人，由于长期暴露于持续性抗原和炎症，T 细胞受到持续刺激，精疲力竭的 T 细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失，称为 T 细胞耗竭（T Cell Exhaustion）。耗竭 T 细胞在功能上有别于效应 T 细胞和记忆 T 细胞，其特点是效应功能丧失，抑制性受体（IRS）表达增高且持续，表观遗传和转录谱改变，代谢方式改变。T 细胞衰竭是癌症病人免疫功能障碍主要因素之一。
1. T 细胞耗竭特征：
效应功能累进式丧失
细胞因子产生缺陷，早期：IL-2和TNF产生缺陷。衰竭期：IFN-γ产生缺陷。可能保留产生趋化因子的能力，包括MIP-1α，MIP-1β，和RANTES等。一般来说，耗竭 T 细胞效应功能丧失因疾病而异，与病原体负荷、病原体复制模式和位置、抗原表达以及炎症环境等有关。
对稳态细胞因子的反应性改变
记忆 T 细胞的一个关键特性：通过细胞因子IL-7和IL-15，以不依赖抗原的方式，维持细胞的功能及稳态自我更新。
在慢性感染过程中，病毒特异性的耗竭 T 细胞，由于IL-7Rα和IL-2/15Rβ信号通路的缺陷，无法通过IL-7和IL-15介导稳态自我更新。
耗竭 T 细胞增殖是通过持续的抗原信号来维持的。但耗竭 T 细胞会失去对额外增殖信号的反应能力，并且对未来的相同抗原刺激没有反应，导致记忆稳态的丧失，也是人类耗竭 T 细胞的一个特征。
持续表达抑制性受体
耗竭 T 细胞的一个关键特征是多IRS的增加和持续表达。免疫检查点抑制剂可以部分地逆转 T 细胞耗竭。
近些年，越来越多的抑制性受体被发现，见下表：
抑制性受体，在效应T细胞中有短暂表达，以确保在其发挥完作用后，功能被抑制，维持免疫稳态，避免自身免疫性疾病。
在许多慢性感染和癌症中，多个IRS的共同表达是耗竭 T 细胞的共同特征，因而联合靶向是目前治疗癌症的主要临床治疗策略。
代谢改变
代谢可塑性是淋巴细胞的一个主要特征，随激活和环境而变化。急性感染期间，CD8+T 细胞线粒体氧化磷酸化从静止状态转化到糖酵解，以满足活化的效应 T 细胞所需的能量。
耗竭 T 细胞的转录图谱显示代谢失调。在体外，PD-1交联减弱PI3K、Akt和mTOR信号，直接影响代谢途径，包括抑制糖酵解。在体内，发育中的耗竭 T 细胞表现出代谢紊乱，包括抑制细胞呼吸、降低葡萄糖摄取和线粒体能量失调。
PD-1阻断可以恢复合成代谢，增强葡萄糖摄取，导致肿瘤微环境中葡萄糖的增加。
细胞转录和表观遗传学改变
与效应T细胞和记忆T细胞相比，耗竭 T 细胞现在被认为有一个独特的转录程序。基因表达的变化包括编码IRS，转录因子，控制TCR信号通路、共刺激和细胞因子信号以及细胞代谢。
2. T 细胞耗竭的相关调节因素
慢性感染或癌症的一个关键特征是 T 细胞持续接触抗原，高抗原负载和长时间的抗原暴露都会导致更严重的 T 细胞衰竭。
促T细胞衰竭的可溶性介质 促进T细胞耗竭的细胞因子IL-10I。L-10是一种STAT3诱导的细胞因子，常与减弱T细胞活化有关。阻断IL-10可预防和/或逆转 T 细胞耗竭。多种免疫细胞类型，包括树突状细胞、B细胞、单核细胞、CD8+T 细胞和非调节性CD4+T 细胞都能产生IL-10。IL-10的作用可能通过STAT3直接作用于 T 细胞，通过APC的调节间接作用于T细胞，或两者兼有。使用IL-10中和抗体结合治疗疫苗，可增强CD8+T
和CD4+T 细胞的应答，减少病毒载量。癌症免疫治疗领域，也在研究类似的方法
TGF-β
TGF-β通过激活下游SMAD转录,减弱或抑制免疫细胞活化。在急性感染过程中，TGF-β作为效应功能的负调节因子,通过抑制T-bet上调促凋亡因子Bim。在慢性病毒感染期间，TGF-β的表达和/或下游SMAD2激活是Tex细胞的特征。
IL-2
IL-2是 T 细胞存活和活化所必需的关键细胞因子，增强感染和肿瘤免疫应答。用IL-2来重振耗竭 T 细胞的治疗效果喜忧参半。与PD-1通路阻断相结合，IL-2在慢性LCMV感染中具有明显的协同作用，为肿瘤免疫治疗提供了一种有吸引力的策略。
然而，在持续感染期间，IL-2也能引起抑制性T细胞（Tregs）的扩张；在HIV感染的情况下，IL-2治疗增加了CD4+T 细胞的数量，但对CD8T细胞和病毒复制的影响不大。然而，增加IL-2对耗竭 T 细胞的影响，同时最小化对Tregs的影响的新策略，在调节慢性感染和癌症的衰竭方面具有相当大的价值。
IL-21
IL-21是另一种与IL-2相似的γ链细胞因子。缺乏IL-21R信号的情况下，CD8+T 细胞无法控制慢性病毒感染，提示IL-21在维持CD8+T 细胞应答和/或拮抗衰竭中起一定作用。
IL-21主要由滤泡辅助CD4+T 细胞产生，直接促进BATF的表达，该转录因子参与启动或维持抗病毒CD8+T细胞功能。在慢性感染期间，IL-21可能维持CD8+T 细胞反应，至少部分拮抗衰竭。
有复杂作用的细胞因子1型IFN1型
IFN（IFN-α/β）是典型的具有双重作用细胞因子。IFN-α/β是关键的促炎性细胞因子，其可通过直接诱导抗病毒活性和激活先天免疫。但是在慢性感染和肿瘤中IFN-α/β可以诱导上调IL-10、IDO、PD-L1和 T 细胞应答的其它阴性调节因子表达。IFN-b/s也可通过Fas/FasL介导的 T 细胞死亡，促进活化 T 细胞的消耗。
T细胞耗竭的非细胞因子因素
除了细胞因子外，其他可溶性介质也与 T 细胞衰竭有关。
前列腺素E2（PGE-2）是由花生四烯酸合成的一种脂质，兼具促炎分子和免疫抑制剂的双重作用，可限制免疫应答。
PGE-2在体外抑制效应 T 细胞的存活和功能，在慢性LCMV感染中阻断PGE-2与PD-1通路阻断协同作用。在细胞外ATP/ADP水解释放腺苷时，腺苷也可作为免疫调节信号，腺苷可通过A2AR和其他腺苷受体来抑制 T 细胞功能，并导致耗竭。
免疫调节细胞
传统的CD4+T细胞一定程度上拮抗CD8+T细胞衰竭。CD4+T细胞的丢失，慢性LCMV感染或者HIV感染导致更严重的细胞衰竭，在慢性LCMV感染的情况下，出现终身病毒血症和不受控制的感染。CD4+Treg具有抑制效应 T 细胞活化和增殖的免疫抑制性质。在急性和早期的慢性感染期间。Treg产生抑制性细胞因子，如IL-10和TGF-β，Treg数量增加HCV感染以及癌症进展。其他免疫调节细胞例如已耗尽的APC、髓细胞衍生的抑制细胞、CD8+Treg、以及NK细胞可促进 T 细胞耗竭
3. T细胞耗竭的免疫疗法
耗竭 T 细胞表达抑制性受体，免疫检查点抑制剂阻断这些信号，已经证实其良好的抗肿瘤作用，逆转耗竭 T 细胞，恢复肿瘤微环境肿瘤浸润T细胞（TIL）功能。
联合免疫疗法
在慢性感染和癌症的背景下，多个抑制性受体（IRS）在耗竭 T 细胞上共同表达，提示多个IRS协同负性调节耗竭 T 细胞。
在慢性LCMV中，共阻断LAG-3和PD-1通路，表现出 T 细胞衰竭的强劲和协同逆转，在肿瘤系统和其他感染模型中也有类似的结果。
靶向IRS和共刺激受体，加入细胞因子或细胞因子阻断 IR 阻断剂，以及检查点阻断与放射、化疗和靶向治疗等更传统的癌症治疗相结合，显示出许多潜在的有益的细胞效应。将PD-1阻断与基于细胞的免疫治疗（如CAR-T细胞）相结合，可以提高逆转T细胞耗竭效应。
自身免疫疾病的耗竭T细胞
自身免疫疾病中 T 细胞显示耗竭 T 细胞的转录特征。由自身抗原长期刺激的自身反应T细胞可能表现出衰竭的特征。针对耗竭 T 细胞的进一步研究，可能对于自身免疫性疾病的治疗，带来新的策略。
PD-1是CD28超家族成员的免疫抑制分子。PD-1主要表达于激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞和活化的单核细胞，由T细胞受体或B细胞受体信号通路诱导，并在肿瘤坏死因子刺激下增强。其主要配体为PD-L1、PD-L2。其中，PD-L1广泛表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多个组织中，可在促炎性细胞因子激活下进一步上调。在机体正常情况下，PD-1/PD-L1通路发挥着重要的免疫调节作用。当肿瘤细胞上高表达的PD-L1与T细胞上的受体PD-1结合时，可传递负性调控信号，诱导T细胞凋亡或导致免疫无能，使肿瘤细胞得以逃避机体的免疫监控和杀伤。同时，PD-1/PD-L1通路激活还可改变T细胞分化，使效应T细胞（effector T cell, Teff）及记忆T细胞（memory T cells, Tm）分化受损，调节性T淋巴细胞（Regulatory T cells, Treg）和衰竭T细胞（exhaustion T cells, Tex）分化上调，从而显著地抑制T细胞免疫效应。当PD-1与PD-L1结合被阻断时，负性调控信号亦被阻断，T细胞可恢复其活性，重新获得杀伤肿瘤细胞的能力。
PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂不同于传统肿瘤治疗手段，而是利用机体自身的免疫系统发挥杀伤肿瘤的作用。目前已在多种实体肿瘤和血液系统恶性疾病中彰显出卓越的疗效，其最大优势是产生持久应答、带来长期生存。在肺癌领域中，针对PD1/PD-L1靶点的药物主要有5种，包括抗PD-1单抗（Nivolumab、Pembrolizumab）、抗PD-L1单抗（Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab）。随着对肿瘤免疫机制的认识不断深入，PD-1/PD-L1抑制剂在挑战与机遇中砥砺前行，多种免疫药物的问世及大型临床研究数据的更新为肺癌的精准化治疗带来更多的选择和希望。
4. PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在晚期NSCLC中的应用
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的80%-85%，大约有30%-40%患者就诊时已进入Ⅲ期/Ⅳ期而失去手术机会。因此，在现有的治疗方案基础上进一步提高疗效和延长生存期一直是肺癌治疗前进的方向。
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文章小结：
肿瘤特异性CD8+T细胞暴露于持续的抗原刺激下，导致一种被称为衰竭的功能失调状态。尽管T细胞耗竭可以限制免疫反应造成的损伤，但效应因子功能减弱，细胞毒性CD8+T细胞在晚期无法控制肿瘤的进展。该路径是一个从激活到祖细胞衰竭再到最终衰竭的动态过程，具有不同的特性。随着增强T细胞功能的免疫治疗技术的迅速发展，新的研究正在深入探讨T细胞衰竭过程中动态分化的机制，并寻找特异性的生物标志物。此外，尽管免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)在临床实践中取得了巨大的成功，但大多数患者对ICIs的疗效仍然有限。前体耗尽的T细胞的扩张和分化解释了ICIs的成功，而前体T细胞池的耗尽和最终耗尽的T细胞的短暂效应功能解释了在肿瘤负担过高的情况下免疫单药治疗的失败。因此，在减少肿瘤负担或扩大T细胞祖细胞池的基础上，迫切需要采用联合治疗策略。
