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今天给大家介绍一篇发表在Hepatology Communications（IF: 5.073）上的单细胞转录组和单细胞核转录组相结合的文章。
scRNA-seq、snRNA-seq和空间转录组鉴定人类肝脏的胆管细胞和间充质异质性
背景介绍
肝脏对人体新陈代谢和免疫功能至关重要。肝脏的基本结构和功能单位是肝小叶，肝小叶由实质细胞（主要是肝细胞）和非实质细胞组成，包括胆管细胞、肝窦内皮细胞 （LSEC）、肝星状细胞 （HSC） 和免疫细胞。研究人员在2018年10月的时候在Nature Communication上发表过一篇题目为”Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations”的文章。他们利用10X scRNA-seq技术手段绘制了人类肝脏细胞图谱，从来自五个人新鲜肝脏组织中分离得到的8444个实质和非实质细胞转录谱，鉴定出20个不同的细胞群，并确定了 20 个不同的细胞簇，包括两个不同的具有免疫调节和炎症特性的肝内巨噬细胞群。但这种方式存在着一定的缺陷，因为解离过程会对肝脏细胞造成一定的损伤，而且胆管细胞和肝间充质细胞如肝星状细胞 (HSC)被检测到的数量也很少。胆管细胞异质性的研究也是了解胆管病（例如原发性硬化性胆管炎）发病机制的关键。所以研究人员本次加入了单细胞核转录组测序技术（snRNA-seq）对四个健康人类肝脏样本进行了测序分析。本研究揭示了应用于人类肝脏的 snRNA-seq 和 scRNA-seq 技术之间的细胞类型组成差异，以及特定于 snRNA-seq 数据的胆管细胞和肝脏间充质细胞亚群。
英文缩略词
CV：central venous（中心静脉）
FB：fibroblast（成纤维细胞）
HSC：hepatic stellate cell（肝星状细胞）
IL：interleukin（白介素）
LSEC：liver sinusoidal endothelial cell（肝窦内皮细胞）
VSMC：vascular smooth muscle cell（血管平滑肌细胞）
研究内容和结果
一、数据质控和整合
1. scRNA-seq和snRNA-seq的组织样本都是四个来自尾状叶的人肝组织。总共从新鲜肝脏解离物中捕获了29432个单细胞，从匹配的速冻组织中捕获了 43863 个单核，都是10× Chromium平台，并且都是相同的质控处理（图1A）
2. 与scRNA-seq相比，snRNA-seq 捕获了更多的基因（图1B）。这些差异主要是由于 scRNA-seq 数据中含有大量的来自编码核糖体蛋白的转录本和线粒体基因组中编码的基因，而snRNA-seq数据中则不存在。
3. 由于存在系统差异，scRNA-seq和snRNA-seq的数据并不会聚在一起。通过对数据进行标准化和特征缩放，合并效果有所改善，但是两种技术之间的差异仍非常显著（图1C）。于是研究人员通过Harmony这种算法来解决了这一问题，实现了scRNA-seq和snRNA-seq数据的整合和共聚类（图1D）。
二、scRNA-seq与snRNA-seq揭示的人类肝脏细胞
1. 研究人员利用已知的标记基因对整合后的数据进行聚类和注释（图1E-G）。所得到的这些细胞类型在 scRNA-seq和snRNA-seq以及所有样本中都存在，只是占比不同。特别是与仅捕获了3%淋巴细胞和5%巨噬细胞的snRNA-seq相比，scRNA-seq捕获了更高比例的免疫细胞（7%的淋巴细胞和9%的巨噬细胞）。值得注意的是，snRNA-seq比scRNA-seq捕获到了更多的胆管细胞和肝间充质细胞（图1F）。
2. 肝细胞是肝小叶的主要实质细胞，负责大部分肝功能。它们表现出从中央静脉到门静脉周围区域的功能分区。通过对肝细胞群进行亚聚类可以得到六个不同的亚群（图2A-B）。这些亚群在scRNA-seq和snRNA-seq以及不同的样本中都存在（图2C-D）。将这些亚群与已报道的小鼠肝小叶显微解剖区域的分区表达相关联，可以将这些亚群中的三个注释为包含中央周围或门静脉周围肝细胞的亚群（图2E）；同时研究人员通过观察已知标记基因（如CYP3A4、ADH4、GLUL和HAL等基因）在整合后的数据集中的肝细胞亚群中的表达情况进一步验证了上述注释的可靠性（图2F）。在其余三个亚群中，IZ1和IZ2这两个亚群代表着人类带间肝细胞（图2E）。进一步对这两个亚群的标记基因在空间转录组学和免疫组化层面进行验证，它们表现出了与门静脉周围或中心周围标记物明显不同的表达模式（图2G-I）。因为根据小鼠肝小叶解剖学分区标记基因有一类亚群并未被注释到，所以研究人员推测剩下的一个亚群是人类特异性的带间肝细胞亚群，但是还有待进一步验证。
总体而言，不管是scRNA-seq还是snRNA-seq，都能很好的捕获到肝细胞，但其中包含的细胞亚群的类型又存在一定的差异。例如根据富集结果显示，更多的肝细胞相关的通路出现在snRNA-seq的数据中（图J）。再如通过snRNA-seq在CV1肝细胞中鉴定的几个重要基因未在scRNA-seq中鉴定出（图2K），而门静脉周围肝细胞的基因表达模式在两种技术中显著相关（图2L）。带间肝细胞的差异比较大，其中许多在snRNA-seq中上调的基因在scRNA-seq中下调（图 2M）。综上所述，研究人员认为snRNA-seq更好的描述肝细胞特征。
3. 胆管细胞是排列在胆管内的上皮细胞，占总胆汁体积的 30%。研究人员之前通过scRNA-seq仅识别出很少的胆管细胞（约1.4%），在本研究中发现snRNA-seq可以捕获更多的胆管细胞（约3.4%），产生总共 448 个胆管细胞样细胞（图 1G）。通过对这个细胞群进行进一步的分类，可以得到六个亚群，标记为Chol-1到Chol-6（图3A）。分别注释为三个ASGR1+肝细胞亚群、两个典型的胆管细胞亚群和一组祖细胞亚群，其中 82%源自snRNA-seq（图3B-F）。这些亚群不是特定出现于某些特定样本中，表明它们不是批次效应或样本异质性造成的（图3D）。同时，这些亚群还形成了从双能祖细胞延伸到肝细胞和胆管细胞命运拟时间线（图3G）。接着研究人员进一步描述了这些亚群的特征，还进行了富集分析（图3F）。为了证明这些被鉴定出的亚群的可靠性，研究人员还在他们2018年发表的scRNA-seq数据中进行的相关的注释，结果发现这些细胞只能使用 snRNA-seq数据进行鉴定（图3H-J）。
4. 各种肝间充质细胞群，如HSC、成纤维细胞 (FBs) 和血管平滑肌细胞 (VSMCs) 被认为是致病性肌成纤维细胞的来源，它们通过产生细胞外基质蛋白促进肝损伤后的纤维化。通过对这类细胞群再聚类可以发现这类细胞可以大致分为七个亚群（Mes1-7），其中只有Mes4这类亚群被两种方法捕获的细胞大致相同，其余亚群大部分来自于snRNA-seq（图4A-D）。通过对各类亚群的特征描述和通路富集分析发现，使用snRNA-seq技术可以发现存在于健康肝脏中数量较少的细胞群，如VSMCs和FBs（图4）。
5. 肝脏血管系统的内皮由 LSEC 和血管内皮细胞组成（图5A），与肝细胞类似，LSEC这类细胞也在snRNA-seq中捕获更多（图B-D）。这些亚群的标记基因和富集通路在两种技术中基本一致，但snRNA-seq中基因表达变化要更小（图5F-I）。
6. 研究人员最后还对肝内免疫相关细胞进行了描述。首先是肝内单核细胞和巨噬细胞。结果发现，snRNA-seq中巨噬细胞的总体比例较高，但snRNA-seq中炎性巨噬细胞的相对比例较低（图6A-D）。虽然snRNA-seq在捕获非炎性巨噬细胞及其相关标记基因的表达变化方面效果要更好（图6B、E），但是scRNA-seq的效果其实也不差，而且描述炎性巨噬细胞的效果要更显著（图6F）。免疫相关通路在snRNA-seq中表达比scRNA-seq 更高（图6G），表明巨噬细胞可能对解离敏感。
7. 最后是肝内淋巴细胞，scRNA-seq的效果明显优于snRNA-seq（图7）。可以观察到淋巴细胞在snRNA-seq中被捕获到的数量明显低于scRNA-seq。
小结
这篇文章通过比较scRNA-seq和snRNA-seq两种技术所得到的数据，揭示了肝脏中主要的细胞分类和特征，描述了这两种技术之间的差异，为不同研究方向采用什么样的技术提供了思路。同时也给读者展示了如果只有正常样本数据又该怎样讲故事。其中富集通路图的绘制还是值得借鉴的。
参考文献
Andrews TS, Atif J, Liu JC, Perciani CT, Ma XZ, Thoeni C, Slyper M, Eraslan G, Segerstolpe A, Manuel J, Chung S, Winter E, Cirlan I, Khuu N, Fischer S, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, McGilvray ID, Bader GD, MacParland SA. Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2021 Nov 18.
