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Nature genetics:不同作物驯化过程中休眠基因的平行选择
9月24日，NG
发表研究作物休眠基因平行选择的文章，其中文章主要得到的结果如下。
1.全基因组关联研究（GWAS）确定了大豆绿色种皮的基因
大豆（Glycine max L.Merr）是一种重要的油籽和蛋白作物。它的种皮颜色在不同的种质中差别很大，有黑色，黄色，绿色，棕色等（图1a）。绿色大豆种皮颜色由三个经典的有不同机制的保持绿色基因座控制，其中G基因座主要控制种皮的绿色，而其他两个基因座影响其他器官。为了确定G基因的遗传基础，作者选择了绿色或黄色种皮的栽培大豆并进行GWAS。 使用标准混合线性模型，确认了染色体1上有显着相关的SNP位点（图1b）。SNP位于Glyma.01G198500，编码CAAX氨基末端蛋白。转录组分析表明，与来自绿色种皮的G核苷酸相比，来自黄色种皮种质的A核苷酸（称为g等位基因）导致了一个可变的剪接位点并产生了早熟终止密码子（图1c）,g的突变导致最后一个跨膜结构域的丧失与G相比（图1d）。
进一步研究Glyma.01G198500是否控制大豆的绿色种皮，我们介绍了来自Kuaipipi的Glyma.01G198500的基因组序列，具有G等位基因和绿色的种皮，有g等位基因的栽培品种DN50是黄色种皮。两个独立的纯合转基因系（T3）的种子是绿色种皮（图1e）。种皮中残留着叶绿素。一致的，当Glyma.01G198500的（CDS）的编码序列在DN50中过量表达时，观察到类似的结果（图1e）。 这些结果证明Glyma.01G198500是大豆中控制绿色种皮的G基因。
图1.确认G基因
2.G是控制大豆种子休眠的驯化基因
在中国大约5000年前，栽培大豆由野生大豆（Glycine soja Sieb和Zucc）驯化而来。野生大豆显示均匀的黑色种子，地方品种展现出可变的颜色，而大多数改良的优良品种都是黄色种子（图1a）。令人惊讶的是，我们发现所有的野生大豆具有G基因型（图2a）。相比之下，地方品种的G比例降至21％，栽培种中降到4％（图2a），表明G在大豆期驯化期间受到了选择。我们进一步使用FST、π和XP-CLR寻找G受选择的证据，结果表明G位于选择性扫描区域中（图2b）。此外，SNP位点（EHHS）的单倍体纯合性表明野生大豆比地方品种和栽培种有更快的纯合性衰减（图2c），确认G是可能与驯化相关的基因。
黑色种皮可以在黑暗，泥泞的环境中保护种子免受捕食。野生大豆总是拥有绿色种皮，因为绿色在黑色背景下是看不见的。G基因的侧翼区域的在驯化期间受到选择，其功能与种皮有关让我们假设它可能与其他重要性状有关，比如种子休眠等特征。因此，我们比较了DN50和转基因品系的种子发芽率，发现了转基因品系的发芽率比DN50慢（图2d，e）。打破休眠后（在室温下储存六个月），转基因和栽培品系的种子表现出相似的发芽率（图2f），表明G不影响发芽率但影响休眠。这些结果表明G是有助于大豆种子休眠的驯化基因。
图2.G是控制大豆种子休眠的驯化基因
3.水稻和番茄驯化过程中G直向同源物的平行选择
种子休眠的丧失，一种典型的驯化特性，有在多个作物家族中反复选择。所以，我们
测试G在不同的物种中是否具有控制休眠的保守功能，它是否经历了平行选择。我们在不同植物中鉴定了不同的G直系同源蛋白，发现它们在C末端表现出高度保守性。水稻属于禾本科，是最重要的主食之一。亚洲栽培稻（Oryza sativa），由两个亚种组成：籼稻和粳稻，是由与其密切相关的野生物种Oryzarufipogon驯化而来。确定是否水稻LOC_Os03g01014（命名为OsG），大豆G的直向同源物（以下简称GmG），在驯化期间也进行了选择，我们重新测序了42个野生稻和134个栽培稻，平均深度约为15×。随后，使用176重测序的种质和66个先前报道的具有高测序深度和高质量的种质进行了全基因组筛选。FST，π和EHHS分析的结果均表明OsG是位于选择性扫描区域（图3a）。
栽培稻的两个亚种籼稻和粳稻形成了两个清晰的簇（图3b和3c的左侧）。我们研究了重新测序的种质与以前的报告的69个野生水稻和328个栽培种中的OsG的单倍型。发现了三个非同义SNP，将群分为五个单倍型（图3d）。而且，SNP3，位于不同物种G直系同源蛋白质C末端的高度保守区域，将种质分为两组（组I：单倍型1和2;组II：单倍型3,4和5）（图3d）。我们确定所有野生稻种质都有组I基因型。除了少数籼稻（183个中的12个），与野生稻具有相同的单倍型，大部分的籼稻和所有粳稻具有组II的基因型（图3d）。观察到大多数粳稻和籼稻固定在OsG（图3c和图3d的右图）表明了这个基因是在水稻驯化的早期阶段选择的，在籼粳分歧之前，或该等位基因能够跨越粳稻和籼稻之间的部分生殖屏障选择使其在两个亚种中都能达到高频率。
确定OsG在水稻中是否也有助于种子休眠，我们从O. rufipogon（IRGC 105491，一种具有单倍型1并称为OsG的野生稻）引入了LOC_Os03g01014的基因组序列转到具有单倍型5的栽培稻ZH11（称为Osg）中。转基因品系与ZH11相比，表现出发芽延迟（图3e，f）。当OsG被引入另一个栽培稻HJ19（单倍型5，Osg）中时观察到了类似的结果。然而，当储存六个月后休眠被打破时，转基因品系和栽培的种子表现出相似的发芽率（图3g），证实OsG影响休眠但不影响发芽率。 随后，使用CRISPR敲除了ZH11中的LOC_Os03g01014。与ZH11相比，敲除的种质有更高的发芽率。此外，OsG是报道的与种子休眠有关的QTL之一，进一步证实了水稻中GmG的直系同源物也有助于种子休眠。
图3.OsG 的驯化和它在种子休眠中的作用
番茄是一种重要的蔬菜，属于茄科。樱桃番茄可能是由红色野生物种（Solanum pimpinellifolium; PIM）驯化而来，发展成大果番茄（BIG）。之前，有共计360番茄种质，包括番茄，樱桃的野生近缘种，和栽培番茄的重测序数据。我们在其中研究了Solyc08g005010（SolyG）的遗传多样性，番茄中的Solyc08g005010是GmG的直系同源物。结果，从FST，XP-CLR和EHHS都表明SolyG是在选择性的扫描区域。进一步的调查在SolyG的第五个外显子中发现了一个非同义的SNP（g.14927），位于高度保守的区域。大部分PIM种质有G等位基因，大多数CER和BIG种质都有C等位基因，表明SolyG也在番茄驯化过程中也受到了选择。
4.G ortholog在拟南芥中具有保守功能。
At2G35260（命名为AtG）是拟南芥中GmG的直向同源物。我们研究了AtG在种子休眠中的作用。相比于野生型（Columbia-0（Col-0），AtG），atg突变体的两个等位基因
（SALK_058830C和SALK_031802）具有显着更快的发芽率（图4a，b）。分层用于打破拟南芥种子休眠,野生型和atg突变体的分层种子都表现出相似的发芽模式（图4c），证明AtG还负责拟南芥的休眠。然而，AtG的作用弱于DOG1（图4b，c）。
我们利用AtG启动子把GmG的CDS和DN50的Gmg转入atg突变体中。发现GmG转基因系完全补充了atg表型，而Gmg转基因系没有（图4b，c）。这些结果表明G直向同源物具有控制休眠的保守功能;然而，结果清楚地表明了等位基因的分歧，GmG和Gmg确实与驯化休眠有关。
文章还从已发表的超过1,000种拟南芥种质的序列中检测了该基因的多态性，确定该集合中存在4种单倍型（图4d）。有趣的是，基于来自数十个种质的休眠数据，我们发现该基因的不同单倍型有显着不同程度的休眠（图4e）。
图4.AtG 在拟南芥中控制种子休眠
5.G通过脱落酸（ABA）途径影响种子休眠
了解G影响种子休眠的潜在机制，我们进行了酵母双杂交筛选。我们发现
AtG与参与ABA生物合成的两种关键酶NCED3和PSY互作（图5a）。相互作用通过荧光素酶互补测定，共免疫沉淀和双分子荧光互补（BIFC）得到了确认（图5b）。我们进一步检测了ABA生物合成前体的含量，结果表明类胡萝卜素生物合成的主要途径，包括β-胡萝卜素，玉米黄质，紫黄质，α-胡萝卜素，和叶黄素在AtG中的含量高于atg（图5c）。一致，测得的AtG的种子中的ABA含量显着高于（P <0.01）atg突变体的种子的（图5d）。同样，在大豆中，GmG基因区域和过表达转基因株系表现出显着高于DN50的ABA含量。这些结果证明G通过调节ABA生物合成来影响种子休眠。因此，作者提出G与NCED3和PSY互动在类胡萝卜素和ABA的生物合成中，影响了种子休眠（图5e）。在突变体g系中，较少产生ABA，导致休眠减弱，促进农民的作物管理，这可能导致g基因型在不同作物中的的平行选择。
图5.AtG和 NCeD3 、PSY互作调节 ABA 的积累
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