肝癌中tp53相关免疫预后模型的建立与验证

今天想要分享的一篇文章是利用TCGA肝癌样本的突变和表达数据进行预后模型构建及免疫特征分析。该篇文章主线简单清晰，主要是（1）根据TCGA数据库中HCC转录组数据和突变数据将HCC分成TP53^WT和TP53^MUT两类样本，（2）对这两类样本进行差异分析，筛选与免疫相关的差异表达基因，（3）然后利用Cox回归分析和LASSO法筛选出关键免疫基因，构建免疫相关预后模型，（4）利用其他数据集验证模型稳定性，（5）最后还根据预后模型将TCGA肝癌样本分成高低风险组，比较两组样本的免疫表型差异及功能差异。

以下是文章主要内容～～～

背景：TP53突变是肝细胞癌(HCC)中最常见的突变，它影响肝癌的进展和预后。

方法：通过研究不同人群和平台中TP53突变状态和RNA表达情况，根据TP53^WT和TP53^MUT HCC样本中差异表达的免疫相关基因建立免疫预后模型(immune prognostic model，IPM)。在此基础上，综合分析IPM对肝癌免疫微环境的影响。

结果:TP53突变导致肝癌免疫应答下调。在312个免疫应答相关基因中，有37个基因在TP53突变状态下有差异表达。本研究以865例HCC患者为研究对象，建立并验证了IPM模型，用来区分预后好（低危）和预后差（高危）的患者。功能富集分析表明，与IPM基因相关的主要功能和途径是体液免疫应答和免疫系统疾病通路。此外，还发现高危组患者T细胞滤泡辅助细胞、T细胞调节(Tregs)和巨噬细胞M0的比例较高，CTLA-4、PD-1和TIM-3的表达高于低危组。TP53突变与肝癌的免疫微环境密切相关。本研究中的IPM对TP53突变状态敏感，可能对确定高低生存风险的HCC患者具有重要意义。

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材料和方法：

2.1 RNA-seq数据

364例肝癌患者的体细胞突变数据，基因表达数据以及对应临床信息从TCGA中获得，在这些样本中有359例同时具有RNA-seq数据和TP53突变信息。

2.2 芯片数据

从GEO中下载三套数据，分别是GSE54236（括78例肝癌样本和77例对照样本），GSE76427（包括115例肝癌样本和52例对照样品），GSE14520（包括225例肝癌样本和220例对照样本）。这三组数据及其生存信息合并进行IPM验证。

2.3 北京协和医院HCC样本收集。

从2004年到2015年，收集131例福尔马林固定石蜡包埋HCC标本，检测免疫基因蛋白水平。

2.4 差异表达基因及基因富集分析（GSEA）

利用edgeR对TCGA中TP53^WT和TP53^MUT HCC样本进行差异基因分析，筛选|log2-fold change (FC)|>2.0 且FDR<0.01的基因作为差异基因。并且利用GSEA对两类样本进行功能富集分析。

2.5 免疫相关预测模型的建立和验证

在359例具有RNA测序数据和TP53突变信息的HCC样本中，有350例具有生存信息的HCC样本进行后续分析。对在TP53^WT和TP53^MUT HCC样本中差异表达的基因进行单变量Cox回归分析，确定每个差异基因的预后价值，其中p<0.001的基因被认为是具有显著预后价值的。然后对这些筛选出的显著的免疫基因中，采用LASSO法筛选出关键免疫基因。最后对这些关键免疫基因进行多元Cox回归分析，构建免疫相关预后模型。应用X-tile 3.6.1软件确定低危和高危HCC患者的最佳阈值点。采用log-rank检验和Kaplan-Meier生存分析评估预后模型的预测能力。

2.6 免疫细胞类型比例评估

CIBERSORT是一种根据复杂组织的基因表达谱来表征细胞组成的方法。利用由547个基因组成的白细胞特征基因矩阵LM22来区分22种免疫细胞类型，这些细胞类型包括髓系亚群、自然杀伤(NK)细胞、浆细胞、幼稚型和记忆型B细胞以及7种T细胞类型。我们使用CIBERSORT结合LM22特征矩阵来估计有和没有TP53突变的HCC样本中22种人类造血细胞表型的比例。每个样本的所有估计免疫细胞类型比例之和等于1。

2.7 IPM与传统临床特征的独立性

在350例有生存信息的HCC样本中，对213例有完整临床信息（包括AFP、性别、体重、年龄、病理分期等）的HCC样本进行后续分析，通过单变量和多变量Cox回归分析来验证预测模型的预测是否独立于传统临床特征。

结果：

1，肝癌免疫表型与TP53突变的关系

在HCC中TP53突变是最常见的突变类型（图1），之前有研究表明，TP53突变与HCC患者的OS有关，但其对HCC患者免疫功能的具体影响需要进一步深入研究。对TP53^WT和TP53^MUT样本进行GSEA分析发现， TP53^WT样本显著富集到414个生物学过程，其中包括4个免疫相关的通路，而TP53^MUT未富集到任何免疫相关通路中。

图1 肝癌样本突变特征及GSEA富集分析

2，在TP53^WT和TP53^MUT HCC样本中鉴别差异表达的免疫相关基因

从上述分析的4个免疫相关通路中获得312个免疫相关基因，使用edgeR对TP53^WT和TP53^MUT HCC样本进行差异基因分析。在312个免疫相关基因中，有37个基因在TP53^WT和TP53^MUT HCCs之间具有差异表达。

3，在TCGA 的HCC队列中构建IPM并评估其预测能力

对37免疫相关差异基因进行单变量Cox回归分析，其中有7个与OS显著相关，然后采用LASSO法筛选出两个关键免疫基因（TREM1和EXO1）。然后对TCGA、GEO和北京HCC组中TREM1和EXO1的表达水平进行标准化，然后将各免疫基因的表达量与多元Cox回归分析的回归系数进行加权，建立预测患者生存的风险评分模型(风险评分= TREM1表达水平* 0.336 + EXO1表达水平* 0.392)。我们计算每个患者的风险评分，根据X-tile软件得到最优cutoff值(1.37)将患者分为高危组和低危组。TCGA中高风险患者的OS较低风险患者短，此外高风险组的风险比低风险组高3.17倍。预测效果AUC曲线如图2c所示。

4，GEO HCC队列和北京HCC队列中IPM的验证和评估

为了确定IPM是否可靠，研究人员在由414名HCC患者组成的GEO HCC队列中评估了IPM的性能。分析结果表明被分配到高风险组的患者OS明显低于被分配到低风险组的患者，高风险组的风险是低风险组的1.97倍。此外作者还将IPM模型与其他研究小组分析建立的3-基因预后模型进行比较，发现IPM模型预测表现更好。

为了进一步检验IPM的稳健性和实际应用，研究人员从北京协和医院招募了一组HCC患者，利用两个免疫基因(TREM1和EXO1)的蛋白水平和生存信息验证了IPM的预后能力。结果表明，在蛋白水平上IPM模型也可以区分出低生存风险或高生存风险的HCC患者。

图2 IPM预后分析及验证

5，根据TCGA HCC队列中TP53状态对IPM OS进行分层分析

与IPM一致，TP53状态也与HCC患者的预后显著相关(图3A)。为了确定IPM的预后价值是否与TP53突变有关，将TCGA HCC患者根据TP53状态分为两组，分层分析表明，在TP53^WT和TP53^MUT HCC样本中，IPM与OS显著相关。此外，单因素和多因素Cox回归分析表明，IPM对HCC患者OS的预测能力与TP53状态无关(图3E)。此外，相关分析表明，在TP53^WT和TP53^MUT HCC组中，风险评分与OS呈显著负相关(图3D)。此外，单因素和多因素Cox回归分析表明，IPM对HCC患者OS的预测能力与TP53状态无关。

由于TP53突变类型影响TP53功能，研究人员对不同的TP53突变类型进行分层分析，发现TP53突变类型影响HCC患者的预后。为了检验IPM的预后价值是否依赖于TP53突变类型，我们对TP53错义突变亚组进行了预后分析，结果表明IPM能够将TP53错义突变亚组分成高低风险组。

图3 TP53突变预后分析

6，低风险表明局部免疫表型增强

在TCGA HCC队列中253例低风险和97例高风险HCC患者之间进行GSEAf分析，低风险组与3个免疫过程相关；而高风险组只与1个免疫过程相关。因此，局部免疫特征可能在低风险组中赋予较强的免疫表型，而在高风险组中赋予较弱的免疫表型。

7，低／高危风险HCC患者的免疫景观图谱

利用CIBERSORT方法结合LM22特征矩阵，研究人员估计了22种免疫细胞类型在低、高风险HCC患者中免疫浸润的差异。在组内和组间，HCC中免疫细胞的比例各不相同(图4A)。因此，肿瘤浸润免疫细胞比例的变化可能代表了个体差异的内在特征。高危HCC患者T细胞滤泡辅助细胞、T细胞调节(Tregs)和巨噬细胞M0的比例明显高于低危HCC患者，T cells CD4 memory resting、T cells gamma delta 和 mast cells resting比例明显低于低危HCC患者。此外，基于上述识别的细胞亚群，基于主成分分析，将高危HCC患者和低危HCC患者的样本明确分为两个离散组(图4D)。因此，这些结果提示HCC中异常免疫浸润和免疫浸润异质性可作为免疫治疗的预后指标和靶点，可能具有重要的临床意义。

图4 低／高危风险HCC患者的免疫景观图谱

此外，研究人员还评估了患者风险评分与关键免疫检查点(CTLA-4、PD-1、TIM-3、lag3、TIGIT)表达的相关性，发现风险评分与CTLA-4、PD-1、TIM-3表达显著相关 (图5A)。此外，还研究了CTLA-4、PD-1和TIM-3在低、高危HCC患者中的表达。高危险HCC组CTLA-4、PD-1、TIM-3表达明显高于低危险HCC组，提示高危险HCC患者预后不良部分原因是免疫抑制的微环境所致(图5B)。

此外对高低风险组进行差异基因分析，鉴定出21个免疫相关差异基因，对这些基因进行GO和KEGG富集分析，分析发现与风险评分相关的基因主要富集于体液免疫反应和免疫系统失调通路(图5D和E)。

图5 风险评分与关键免疫检查点相关性及富集分析

8， IPM独立于传统临床特征

采用单因素和多因素Cox回归分析，探讨IPM的预后价值是否独立于TCGA HCC队列中的其他临床因素。在调整了临床特征(包括性别、年龄、病理分期、血管肿瘤浸润、乙肝和丙肝状态)后，IPM仍然是一个独立的预后因素 (图6A)。多因素Cox回归分析表明，IPM与生存信息显著相关(p0.01)，最高中位风险评分(HR = 2.94, 95% CI = 1.70-5.08)。此外，我们还比较了IPM与常规临床特征的C指数，在11个生存预测因子中，IPM的平均C指数(0.6380)高于常规临床特征(0.5001 ~ 0.5900)(图6B)。这些结果表明IPM独立于传统的临床特征，在生存预测方面比传统的临床特征表现更好。

最后为了给临床医生提供预测HCC患者预后的定量方法，本文构建了综合IPM和独立临床危险因素(丙型肝炎和血管肿瘤侵袭)的nomogram（图6C）。

图6 IPM与临床特征相关性

好啦，到此为止这篇文章就接近尾声了，内容充实，结果精彩，图又漂亮，真是一片不错的文章啊!

参考文献：Development and validation of a TP53-associated immune prognostic model for hepatocellular carcinoma

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