免疫刺激的CAFs亚群可预测头颈癌的免疫治疗反应

导读：

抗PD-1免疫检查点抑制剂(ICI)是目前治疗复发/转移性头颈部鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma ，HNSCC）的一线药物。然而，其总体应答率可能低至20%，在PD-L1表达升高和肿瘤浸润性T细胞的肿瘤中，应答率会增加。虽然这在一定程度上是T细胞依赖的机制，但在肿瘤微环境(TME)中可能有额外的细胞亚群介导对ICI的反应。近期研究表明，癌症相关成纤维细胞(CAF)与这种耐药性有关，但在人类TME中，但它们在免疫调节中的作用仍不清楚。本文利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析4例接受了αpd-1治疗HNSCC患者。从scRNA-seq队列中获得的Head and Neck CAF(HNCAF)蛋白活性图谱用来对28例患者的bulk转录图谱的parental cohort进行蛋白质活性富集分析。最后，采用体外共培养实验验证HNCAF亚型的功能。作者的研究结果表明不同的HNCAF亚群在人HNSCC的免疫调节环境中具有重要的功能¹。

结果解读：

• 单细胞转录图谱的蛋白质组主调控网络分析确定HNSCC微环境中功能独特的CAF群体

作者使用scRNA-seq分析nivolumab治疗前后的肿瘤细胞，seurat的基因表达聚类显示了12个不同的细胞群。为了获得更高的细胞亚群特征的分辨率，作者在ARACNe算法的基础上用每个簇的scRNA-seq图谱来推断亚群特有的基因调控网络，然后用VIPER进行蛋白质活性分析。基于蛋白质活性的重新聚类发现了另外两个先前未被检测到的簇，总共14个不同的细胞簇，这两个簇在4名患者中表达一致(图1A)。作者用热图可视化这些细胞群体之间的差异，并显示出每个簇中最具差异的五种蛋白质(图1B)。作者首先评估了这些由VIPER产生的簇对治疗的改变做出反应的能力。正如预期的那样，基因表达和蛋白质活性分析都显示，nivolumab治疗后T细胞和IFNγ蛋白活性增加(图1C)。进一步研究其他细胞群体丰度的变化时，VIPER聚类法和基因表达聚类法均能显示成纤维细胞之间的异质性，并且有两个簇(第4和第9簇)在治疗后细胞比例显著增加(图1C)。利用SingleR的细胞谱系推断，确定这两个簇为成纤维细胞，表明头颈癌中PD-1靶向免疫治疗与CAF上调有关(图1D)。此外，另外两个簇(簇6和簇7)也被SingleR描述为成纤维细胞(图1D)，但是在在免疫治疗后没有表现出显著的差异，这表明在HNSCC TME中存在功能不同的CAF亚群。

• VIPER成纤维细胞聚类识别出与免疫治疗反应和耐药性相关的独特亚群

为了进一步评估HNSCC的TME中不同CAF亚群之间的功能差异，作者使用ARACNe和VIPER对成纤维细胞进行了基于蛋白质活性的亚群聚类。最终确定了五个不同的CAF簇，初步命名为HNCAF-0至HNCAF-4 (图2a)。但是，基于基因表达的成纤维细胞亚群仅确定了两个不同的CAF群体。在蛋白质活性聚类鉴定的五个HNCAF群体中，HNCAF-0和HNCAF-3的细胞比例增加，HNCAF-1和HNCAF-2的细胞比例减少，而HNCAF-4的细胞比例不受影响(图2B)。在五个簇中，前10个最具差异活性的蛋白质，作者以不同活性转录因子和信号分子的排序列表的形式，突出了它们潜在的功能特性(图2C)，以更好的理解每种HNCAF表型的分子生物学。为了评估每个HNCAF亚群与αPD-1免疫治疗的临床反应的相关性，作者使用HNCAF分子特征来分析28名患者parental cohort的Bulk RNA-se谱（对nivolumab反应）。αPD-1免疫治疗后，在治疗前患者中（有反应），HNCAF-0和HNCAF-3标记基因在统计学上显著丰富(图2D)。这一结果表明，在接受nivolumab治疗后，HNCAF-0和HNCAF-3亚群也会扩大，提示这可能是预测人类HNSCC临床疗效的指标。相反，HNCAF-1、HNCAF-2和HNCAF-4细胞在治疗后没有扩张，它们的标志物在有反应者和无反应者中没有明显富集。

• 成纤维细胞亚型分析揭示了HNSCC的新分类

作者使用流式细胞术对手术标本中CAF的浸润度进行了量化。CAF丰度，按照CD45^- EpCAM^- CD31^- 定义的话，占活细胞总数的12%至58% (图3A)。根据CD29和FAP的表达（流式），以前在乳腺癌中发现了不同的CAF亚群，称为CAF-S1、CAF-S2、CAF-S3和CAF-S4。Kieffer团队表明，在HNSCC中可以发现CAF-S1，但在HNSCC中是否存在其他CAF-S群体仍不清楚。然后，作者证实了乳腺癌中四个CAF-S亚群在HNSCC中的存在(图3B)。CAF-S1和CAF-S2的丰度最高，而CAF-S3和CAF-S4的丰度非常低(图3C)。

作者还检测了之前定义的iCAF和myCAF基因集标记的一致性，这是在胰腺癌中首次描述的。Cell-by-cell富集分析显示在HNCAF-1细胞中ICAF特征富集和在HNCAF-2细胞中MyCAF特征富集。作者在图3D总结出HNCAF与乳腺癌或胰腺癌CAF表型之间的相关性。虽然HNCAF-0和HNCAF-3与CAF-S1细胞有一些相似之处，但作者认为HNCAF-0和HNCAF-3代表了新的成纤维细胞亚群，这些可能是头颈癌所特有的，并可以预测患者的预后(图2D)，这与ICAF/myCAF的分类并不完全匹配。总体而言，这些数据显示，VIPER分析对HNCAF的分类具有更高分辨率，更关键的是，通过VIPER识别的HNCAF群体与HNSCC的预后有显著的相关性。

• 与HNCAF-1相反，HNCAF-0在TCGA中与更好的预后相关

在没有免疫治疗的环境中，作者为了评估CAF群体的预后相关性，量化了TCGA HNSCC队列中HNCAF蛋白活性特征的富集程度(图4)。结果显示，在TCGA患者中，HNCAF-0信号显著富集，总存活率较高(图4A)，这表明这些细胞不仅是免疫治疗反应的重要调节因素，而且可能在HNSCC的临床相关的内源性免疫反应方面发挥关键作用。相反，当有足够数量的患者时，HNCAF-1蛋白活性特征与早期总体生存率较差有关(图4B)。HNSCC的预后与TCGA队列中较高的TIL水平有关，这些结果与VIPER来源的HNCAF细胞的不同免疫调节功能作用一致。

• HNCAF-0/3细胞在功能共培养实验中抑制TGF-β依赖的T细胞衰竭

作者研究了HNCAF-0和HNCAF-3细胞与其他TME亚群的潜在相互作用。相互作用组分析表明，HNCAF与CD8 T细胞的受体-配体相互作用比HNCAF与TME中的任何其他细胞亚型都要多。作者首次使用αSMA, αCD8, 和αcytokeratin抗体分析了HNSCC组织中CAF的整体浸润模式。多重免疫荧光图像显示CAF与CD8⁺T细胞共同定位于间质(图5A，白色箭头)。另外，当HNCAF-0/3细胞与T细胞（来自正常人的PBMC）共同培养时，HNCAF-0/3细胞降低了外源性激活的CD8 T细胞中PD-1⁺ TIM-3⁺的耗竭表型，增加了CD103⁺NKG2A⁺的组织驻留记忆T细胞表型(Trm)，以及它们的细胞溶解功能（由于穿孔素和颗粒酶B的表达）(图5B)。Transwell共培养分析表明，上述现象的出现是由于细胞之间的接触导致(图5C)。此外，HNCAF-0/3细胞与肿瘤浸润性T细胞（直接从人HNSCC标本中分离）的共同培养可导致CD8 T细胞的Trm表型和细胞毒作用增加，但HNCAF-0/3细胞不能挽救终末耗尽型肿瘤浸润性T细胞的耗尽表型(图5D)。总之，HNCAF-0/3细胞强烈促进肿瘤浸润性T细胞中活化标志物、穿孔素、颗粒酶B和IFNγ的产生(图5D和E)。在培养的过程中，跟CD103⁺细胞一样，作者发现HNCAF-0/3完全拯救了TGFβ介导的PD-1/TIM-3的表型，而不抑制总的TGFβ信号 (图5F)。

为了评估CAF对每个HNCAF群体的T细胞耗竭的影响（在没有有效抗体的情况下），作者利用DSP的数据来评估HNCAF-0和HNCAF-1蛋白活性信号在T细胞功能衰竭信号富集的区域的共定位。HNCAF-0的特征与TME感兴趣区域的T细胞耗尽特征没有显著关联(图5G和H)。然而，尽管反复实验，与HNCAF-1共培养的T细胞迅速死亡，留下活细胞的数量不足以用于进一步分析(图5I)。单独培养T细胞或与HNCAF-0/3细胞共培养均未观察到T细胞死亡，提示HNCAF-1在体外介导了加速的T细胞凋亡。

• HNCAF-0可预测αpd-1封闭抗体的临床结局

为了测试这些HNCAF亚群的潜在能力，作者接下来根据肿瘤类型对TCGA中的HNCAF蛋白活性特征进行了富集分析，重点关注了具有高间质细胞含量的肿瘤。富集分析表明，HNCAF-0的富集是HNSCC特有的，而HNCAF-1的富集更为普遍。有趣的是，HNCAF-1的升高在胰腺癌中最显著，众所周知，胰腺癌对基于PD-1的免疫治疗没有反应。HNCAF-1的表型与先前定义的胰腺癌ICAF亚群相匹配(图3D)。

为了从外部验证HNCAF-0/3在临床反应预测方面的潜力，作者在另一组接受αpd-1免疫治疗的HNSCC患者中测试了蛋白质活性特征的富集分析。分析显示，在患者（对pembrolizumab有反应）的治疗前样本中，HNCAF-0和HNCAF-3标志基因在统计学上显著富集，作者在一个独立的队列中证实了HNCAF-0/3与免疫治疗反应的关联(图6A)。虽然没有HNCAF-0和HNCAF-3那么显著，但对这一队列的分析也显示，HNCAF-2显著富集(图6A)。HNCAF-3，与无反应患者相比，有反应患者的总体富集度最强(图6A)，AUROC下的预测区域也最高，AUROC为0.8(图6B)，与文献报道的PD-L1肿瘤比例评分(AUROC=0.66)和PD-L1联合阳性评分相比有改善。

全文总结：

在这项研究中，作者使用VIPER算法分析蛋白质活性谱识别出五种分子上不同的CAF亚型。另外，作者利用新辅助临床试验中生物样本来表明，两个亚型，HNCAF-0和HNCAF-3，可以预测出PD-1检查点阻断治疗的良好反应。此外，作者还发现HNCAF-0/3细胞对CD8 T细胞具有免疫刺激作用，而HNCAF-1细胞与免疫抑制有关。作者的发现证明了不同的HNCAF亚群在调节人HNSCC的免疫调节环境中的重要性。

参考文献：

1. Obradovic A, Graves D, Korrer M, et al. Immunostimulatory cancer-associated fibroblast subpopulations can predict immunotherapy response in head and neck cancer. Clin Cancer Res Mar 9 2022.