大家好呀！今天要给大家分享的是发表于PNAS（IF：11.205）上的一篇文章。话不多说，我们一起来看看吧~

致病性 TNF-α 在 Aire 缺陷型自身免疫模型中驱动周围神经炎症

背景介绍

1. TNF α

肿瘤坏死因子-α. （TNF-α）是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应。其主要作用是调节免疫细胞的功能。

2. 疾病介绍

格林－巴利综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病 （chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，CIDP）都是周围神经系统 (PNS) 的炎症性疾病，临床特征包括虚弱、感觉丧失、反射消失和疼痛等。GBS 和 CIDP 是由涉及细胞和体液因素的周围神经髓鞘的自身免疫性破坏引起的，但这种自身免疫性破坏对周围神经髓鞘的免疫耐受的确切机制尚不明确。目前常见的临床治疗仅限于非特异性作用机制的治疗手段，如静脉注射免疫球蛋白、糖皮质激素和治疗性血浆置换等。

3. NOD.Aire^GW/+小鼠介绍

在非肥胖性糖尿病（NOD）遗传背景下，携带显性功能丧失 Aire G228W 突变的小鼠（NOD.Aire^GW/+小鼠）会出现自发性自身免疫性周围多发性神经病（SAPP），概括了 GBS 和 CIDP 的多个特征。由于 SAPP 和人类炎症性神经病之间的多个共同特征，该小鼠模型是了解炎性神经病致病机制的常用模型之一。

数据组成

1. 本研究中产生的NOD.Aire^GW/+小鼠scRNA-seq数据（GSE180498）；
2. 已发表文献中的野生型 C57BL/6 (B6.WT) 和 NOD (NOD.WT) 小鼠scRNA-seq数据（GSE142541）；
3. 已发表文献中的巨噬细胞的scRNA-seq数据（GSE142541和GSE144708）。

结果

1. 神经性 NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神经中的异质免疫细胞中多种细胞因子通路上调

为了解坐骨神经中的免疫细胞组成，研究人员对来自神经性 NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神经的免疫细胞进行scRNA-seq分析（图 1A），共鉴定出11 个免疫细胞群，包括有CD4+ T 细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞、γδ T 细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞、B细胞、浆细胞以及巨噬细胞等（图1B-D）。流式细胞分析结果显示，T 细胞（包括 Cd4、Cd8 和 Treg）是构成坐骨神经浸润免疫细胞的主要细胞群，其次是 B 细胞、巨噬细胞、cDC和pDC等细胞（图1E）。图 1 F-H结果显示，IFN-γ 反应和通过 NF-κB的TNF-α 信号传导途径在骨髓组（cDC 和巨噬细胞）细胞中表达显著，且巨噬细胞高度表达通过 NF-κB的TNF-α信号传导通路中的相关基因。综上，研究人员推测骨髓细胞中显著存在的TNF-α 介导的信号传导可能在 SAPP 发展中起重要作用。

2. IFN-γ 由 T 细胞表达并诱导NOD.Aire^GW/+巨噬细胞中的 TNF-α 表达。

细胞通讯分析结果显示，IFN-II（也称为 IFN-γ）和TNF 信号通路网络是免疫细胞群之间重要的信号通路，CD4+ 和 CD8+ T 细胞为IFN-γ 主要的来源细胞，骨髓细胞群为IFN-γ主要的靶细胞（图 2A-C）。图 2 D-F结果显示，巨噬细胞是TNF-α 的主要来源，多种免疫细胞类型（包括巨噬细胞本身）是 TNF-α 靶细胞。同时，图 2G流式细胞分析结果显示，TNF-α 蛋白主要由 F4/80⁺ 巨噬细胞表达。与非巨噬细胞群相比，F4/80⁺ 巨噬细胞中 TNF-α 表达的平均荧光强度显著更高（图 2H）。据报道，IFN-γ 可诱导巨噬细胞中的 TNF-α 表达，故研究人员推断由NOD.Aire^GW/+小鼠神经中的 T 细胞产生的 IFN-γ 可能是刺激巨噬细胞 TNF-α表达的信号。为验证其猜测，研究人员从NOD.Aire^GW/+ 小鼠中分离出骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)，并在存在或不存在 IFN-γ 的情况下分别对其进行培养。实验结果显示，与未受刺激的 BMDM 相比，暴露于 IFN-γ 的 BMDM 中TNF-α 的表达显著上调（图2I）。

3. TNF-α介导的信号在自身免疫靶向的坐骨神经中上调

图 3A流式细胞分析结果显示，与NOD.WT小鼠相比， NOD.Aire^GW/+ 小鼠的坐骨神经中 CD45+ 免疫细胞数量呈指数增加。研究人员通过对来自稳态（B6.WT和NOD.WT）与自身免疫性（NOD.Aire^GW/+）小鼠的坐骨神经免疫细胞 scRNA-seq 数据进行组合分析，共鉴定出12 个主要免疫细胞群（图 3B），其中Ctla4+ T 细胞仅来源于自身免疫性NOD.Aire^GW/+小鼠（图 3C）。

研究人员接下来又对来自稳态和自身免疫性小鼠坐骨神经的免疫细胞之间的细胞信号模式进行比较分析。结果显示，与 NOD.WT 相比，NOD.Aire^GW/+ 样本中的信息流显著增加，且仅在NOD.Aire^GW/+坐骨神经中鉴定出IFNII（IFN-γ）和TNF信号通路（图 2 D）。TNF-α 信号通路中的TNFR1 和 TNFR2受体分别由Tnfrsf1a 和 Tnfrsf1b 编码，图2E-F结果显示，Tnfrsf1a 在巨噬细胞和 cDC 细胞中表达显著增加，Tnfrsf1b 在 T 细胞、gd/NK/NKT、混合和巨噬细胞群中显著增加。此外，与 NOD.WT 相比， NOD.Aire^GW/+的巨噬细胞群中的 Tnf 表达增加（图 3F），并通过RT-qPCR和免疫组化染色得到验证（图 3G-H）。

4. 自身免疫与损伤巨噬细胞的单细胞转录组特征差异

为进一步比较损伤和自身免疫性巨噬细胞的单细胞转录组特征变化，研究人员对来自损伤巨噬细胞和自身免疫性巨噬细胞的 scRNA-seq 数据进行整合分析。通过聚类分析共划分出7个不同的groups，其中group 1和group 2的巨噬细胞主要来源于 D1 损伤巨噬细胞，group 3和group 4的巨噬细胞主要来源于 D5 损伤巨噬细胞（图 4 A 和 B）。值得注意的是，group 7巨噬细胞中 Tnf 表达最高（图4C）。GSEA分析结果显示，通过 NF-κB 的 TNF-α 信号传导是group 7巨噬细胞中最为显著的信号传导途径之一（图4D）。此外，拟时间分析结果显示，group 7巨噬细胞为 D5 损伤巨噬细胞轨迹的延伸（图4E），故研究人员推测其中发生的表型变化是从神经损伤修复结束时的修复状态变为具有自身免疫的促炎状态。

5. 自身免疫性周围神经病通过抗 TNF-α 抗体治疗和基因 TNFR 消融得到改善

研究人员为确定 TNF-α 是否是周围神经自身免疫性脱髓鞘所必需的，通过在小鼠模型中进行抗体介导的 TNF-α 阻断效果测试。结果显示，虽然所有未经治疗的 7 只小鼠都出现神经病变，但抗 TNF-α 抗体治疗的 14 只小鼠中有 13 只成功预防神经病变（图 5A）。H&E 染色和流式细胞分析结果显示，抗 TNF-α 治疗的NOD.Aire^GW/+小鼠的免疫浸润显著降低（图 5 B 和 C）。

接下来，研究人员还遗传方法验证TNF-α 阻断对 PNS 自身免疫发展的影响，构建了TNFR1 和TNFR2双缺陷型NOD.Aire^GW/+小鼠（NOD.Aire^{GW/ +}Tnfrsf1a^-/- Tnfrsf1b^-/-）。实验结果显示，虽然所有NOD.Aire^GW/+小鼠（n = 16）在 30 周龄时出现神经病变，但NOD.Aire^{GW/ +}Tnfrsf1a^-/- Tnfrsf1b^-/-小鼠（n = 19）可以成功预防病变出现（图 5E）。综上结果显示，通过用抗 TNF-α 抗体治疗或通过 TNFR1 和 TNFR2的遗传缺陷阻断 TNF-α 活性，可防止自身免疫性周围神经病变的发展。

6. TNFR1 促进 PNS 自身免疫并诱导NOD.Aire^GW/+巨噬细胞中多种自身免疫相关基因的表达

研究人员进一步探究了TNFR1 缺失对神经病变发展的影响，图6A结果显示，仅有TNFR1 缺失也可保护NOD.Aire^GW/+小鼠免受SAPP病变。H&E 染色和流式细胞分析结果显示，来自 TNFR1 缺失型 (Tnfrsf1a^-/-) NOD.Aire^GW/+小鼠坐骨神经的免疫浸润程度显著降低（图 6 B 和 C）。此外，对坐骨神经的神经传导研究表明，TNFR1缺失可防止脱髓鞘（图 6D）。

小结

本文通过单细胞 RNA 测序分析自身免疫攻击期间神经中的免疫细胞，揭示了一个巨噬细胞介导的TNF-α信号网络，该网络在受自身免疫影响的坐骨神经免疫细胞中显著上调。自身免疫相关 T 细胞产生IFN-γ，促进巨噬细胞中 TNF-α 的表达上调。相比之下，损伤后周围神经巨噬细胞中 TNF-α 的表达和信号传导会显著降低，这表明最大限度地减少 TNF-α 活性可能是实施修复性巨噬细胞状态的关键。事实上，TNF-α 信号的基因消融以及基于抗体的 TNF-α 阻断，可以防止自身免疫性神经病变的发展。综上所述，增加的 TNF-α 信号传导是 PNS 自身免疫的一个决定性特征，可能将是一个有效的临床治疗手段。

参考文献

Wang Y, Guo L, Yin X, McCarthy EC, Cheng MI, Hoang AT, Chen HC, Patel AY, Allard Trout D, Xu E, Yakobian N, Hugo W, Howard JF Jr, Sheu KM, Hoffmann A, Lechner MG, Su MA. Pathogenic TNF-α drives peripheral nerve inflammation in an Aire-deficient model of autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jan 25;119(4):e2114406119.