今天介绍的这篇Hexokinase 3 dysfunction promotes tumorigenesis and immune escape by upregulating monocyte/macrophage infiltration into the clear cell renal cell carcinoma microenvironment六月份发表在International Journal of Biological Sciences（IF:4.858），文章基于TCGA、GEO、真实世界ccRCC队列和约15000个癌症样本，确定HK3的预后价值和免疫意义。研究首次揭示HK3可影响糖酵解，促进恶性生物学过程，预测ccRCC的侵袭性进展。

数据来源

生物微阵列数据：从TCGA数据库获得KIRC患者的RNA测序数据进行分析。ESTIMATE算法用于计算免疫和基质得分。

来自训练和测试队列的患者和转录表达谱: 从TCGA数据库获得533名ccRCC患者的RNA测序数据。从2009年8月至2018年5月，连续招募FUSCC（中国上海）泌尿科的377名ccRCC患者进行分析，手术期间收集ccRCC和正常组织样本。

GEO和 Oncomine数据库: 从GEO数据库和Oncomine在线数据库中获得了ccRCC患者HK3的转录表达谱。从GSE15641（32个ccRCC样本）、GSE53757（72个ccRCC样本）和GSE66270（14个ccRCC样本）数据集中选择118个ccRCC原发肿瘤和邻近正常组织。

生信分析

免疫渗透分析：Tumor IMmune Estimation Resource、TISIDB

生存分析：95%CI的Kaplan-Meier法、对数秩检验、Cox logistic回归模型

基因集富集分析（GSEA）数据的处理：Category version 2.10.1包

蛋白质相互作用（PPI）网络的建立及功能富集分析：在线数据库GeneMANIA

实验设计

RT-qPCR分析、蛋白质印迹分析、细胞培养和转染、细胞活力测定、细胞凋亡与细胞周期测定、使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据绘制HK3表达图谱

结果

ccRCC与多组正常人差异表达HK3的鉴定

研究首次鉴定了与糖酵解信号通路相关hub基因的差异表达，比较TCGA队列中533例ccRCC患者的ccRCC组织与邻近正常组织之间的差异（图1A），与GSE15641，GSE53757和GSE66270中的相邻正常组织相比，118个ccRCC原发肿瘤中HK3的表达显著更高（图1B-D），与TCGA-KIRC队列中72个正常组织相比，533个ccRCC组织中HK3表达的转录水平显著高表达（图1E）。

HK3表达与免疫细胞浸润的丰度相关

Spearman相关性表明，HK3与ccRCC微环境的免疫环境、基质环境和肿瘤纯度之间有很强的相关性（图1F-H）。HK3表达与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞，尤其是巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润显著相关，促使ccRCC免疫微环境的普遍激活（图1I）。

HK3在癌症中的预后意义

分析所有癌症中HK3的表达（图2A），在12452例泛癌样本中，HK3的高表达与预后恶化、分期增加和分级增加显著相关（图2B-D）。此外，从GEO数据集中收集了2476名膀胱癌、血液癌、脑癌、乳腺癌和肺癌患者的临床数据（图2E）。总的来说，这些发现说明了HK3对肿瘤进展和不良预后的预测作用。

TCGA队列中ccRCC患者HK3表达与晚期临床病理参数相关

如图3A-B所示，ccRCC样本中的HK3 mRNA表达与临床晚期、病理分级显著相关。K-M方法显示，在TCGA队列的533例ccRCC患者中，HK3表达升高与OS缩短显著相关（图3C）。在多变量Cox回归分析中，TCGA队列中ccRCC患者的传统预后因素与OS相关（图3D）。TCGA-OS的AUC指数为0.775（图3E），显著高于传统临床病理因素和其他模型的预测能力，突出了HK3对ccRCC预测能力的准确性和一致性。

单因素Cox分析显示病理性TNM分期、AJCC分期、ISUP分级和HK3表达是533例ccRCC患者的预后指标（补充图1）。

亚组生存分析显示HK3表达与ccRCC患者预后不良相关

HK3是预测ccRCC患者预后和生存的一个潜在的肿瘤标志物（图4）。

FUSCC队列中HK3 mRNA表达与晚期ccRCC患者临床病理参数的相关性研究

与正常组织相比，ccRCC组织中的HK3表达在蛋白质水平上显著升高（图5A），96.6%的患者肿瘤组织中的HK3表达水平高于正常组织（图5B）。生存曲线显示，在FUSCC队列中377例ccRCC患者中，HK3 mRNA水平升高与PFS和OS减少显著相关（图5C-5D）。基于FUSCC队列，HK3扩增与PFS和OS减少显著相关（图5E-5F）。

HK3的转录表达和临床病理特征在两队列分类数据分布上是平衡的

如表1所示，在FUSCC队列中，HK3 mRNA表达增加的ccRCC患者与晚期pT、pN、pM分期、AJCC分期和ISUP分级显著相关。此外，在TCGA队列中，HK3 mRNA表达增加与晚期pT、pM分期、AJCC分期和ISUP分级显著相关。

HK3调节细胞增殖并影响糖酵解

HK3在shRNA-1转染组、shRNA-2转染组细胞中的表达水平显著降低，在A498和786O细胞中，HK3过表达转染组的表达水平显著升高（图6A）。与正常对照组相比，shRNA-1、shRNA-2组的HK3转录表达也显著降低，而过表达组则显著升高（图6B）。shRNA-1、shRNA-2或过表达上调或下调HK3后，HK3 shRNA-1组细胞生长值较正常对照组显著降低 (图6C-D）。HK3过表达显著增加葡萄糖摄取和乳酸分泌。相反，HK3基因敲除可抑制葡萄糖摄取和乳酸分泌（图6E-F）。

HK3调控细胞凋亡、细胞周期和克隆形成

GSEA表明，HK3明显参与了ccRCC的凋亡（图6G）。如图6H-I所示，HK3过表达与通过碘化丙啶（PI）和FITC-膜联蛋白V荧光测定的shRNA-1细胞组相比显著减少了凋亡细胞。重要参与通路包括G2/Mcheckpoint和有丝分裂纺锤体（图6J-K）。转染后发现，与阴性对照相比，HK3在G0/G1和G2/M期增加，S期减少（图6L-M）。同时，HK3的抑制显著降低了ccRCC细胞的增殖，HK3的过表达显著提高了ccRCC细胞的增殖能力（图6N-O）。

HK3与ccRCC微环境中单核/巨噬细胞浸润及脂质代谢相关

GSEA分析显示100个重要基因的转录表达谱在热图中的正相关和负相关（图7A）。参与脂质分泌的M2巨噬细胞表面分子，如CD163、VSIG4、MS4A4A、ITGAM和ITGAX，炎症细胞浸润的比例随着HK3表达的升高而显著增加（图7B-C）。在图7D-F中，HK3的活化程度不仅与CD33+CD163+肿瘤相关单核细胞、VSIG4+M2型巨噬细胞的浸润水平密切相关，还与参与脂质合成的细胞内下游信号以及CD36、FABP5、FASN，FTO和其他介导肾组织脂质形成过程和脂质转运的标志物相关。

HK3及其相关基因的功能富集分析

如图8A所示，进行了HK3和相关20个基因的基因-蛋白质相互作用。在GO和KEGG通路中，发现HK3与糖酵解/糖异生、对细菌的防御反应、碳水化合物激酶活性和免疫反应密切相关（图8B）。

HK3通过调节单核/巨噬细胞浸润与免疫检查点分子相关

如图8C-D所示，HK3主要定位于或结合于单核细胞/巨噬细胞。热图显示HK3在三个scRNA-seq数据集的不同细胞类型中相对较高的表达（图8E）。如图8F所示，HK3与许多免疫检查点分子丰度具有显著相关性，HK3高表达组较HK3低表达组免疫检查点分子表达明显升高（图8G）。

HK3可能参与肿瘤免疫微环境重塑

为了探讨HK3是否参与所有癌症的免疫排斥微环境，提取了10201个多发肿瘤组织中siglec15、IDO1、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA-4、LAG-3和PDCD1LG2的表达值（图8H）。在图S2A中，HK3在各种癌症的免疫微环境中发挥重要作用，HK3与肿瘤新抗原，特别是前列腺癌和结肠癌之间有很高的关系（图S2B）。在图S2C-D中，HK3与免疫细胞的各种表面分子和免疫检查点分子显著相关。

小结

这篇文章在大规模人群队列研究的基础上评估了HK3在ccRCC和泛癌中的差异表达水平对预后的影响。针对ccRCC肿瘤微环境中免疫细胞浸润的多样性和复杂性，从特异性免疫细胞亚群的鉴定、功能表型分析和机制探讨三个方面进行研究。采用了复杂的生物信息学方法，包括免疫浸润分析（TIMER 、ESTIMATE 算法、CIBESORTE 算法等）、多组学数据（蛋白质组学、转录组学、免疫组学、单细胞RNA序列等）和多个ccRCC队列，衔接分子生物学背景和临床价值，其中不论是方法综合性还是实验设计，工作量都很大，却不乏亮点，很值得学习。