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技术方法

分别从胎儿和成人组织中分离出肠道细胞，利用磁性活化细胞分选法（MACS）进行收集；将来自儿童患者的肠道类器官在基质凝胶中培养，用于RNA的提取，RNA的提取、逆转录和定量PCR；10x Genomics Chromium GEX文库制备和测序；基于5′ 10x Genomics Chromium cDNA文库制备10x Genomics V(D)J文库；基于Plate的Smart-seq2；10x Genomics scRNA-seq数据的预处理以及质控（扩图1.b）；对细胞谱系亚聚类并注释细胞类型和状态；细胞类型评分；肠道类器官分析；Smart-seq2测序数据的预处理与分析；对BEST4细胞的丰度差异分析；RNA速率和伪时序分析；单细胞BCR分析；细胞通讯分析；肠神经系统疾病相关基因的表达分析；利用多元数据的细胞类型组成分析；炎性肠病全基因组关联研究（IBD-GWAS）基因的细胞类型富集分析；10x Genomics Visium空间转录组样本的制备和数据处理；使用cell2location对细胞类型进行空间映射；冷冻切片，单分子荧光原位杂交和共聚焦成像；流式细胞术验证小鼠簇状细胞中的Fcgr。研究用到的所有软件和代码也都可以通过文章提供的链接获取到。

研究结果

人类肠道细胞的整合图谱

研究对妊娠中期和成人肠道以及肠系膜淋巴结（mLN）的不同组织区域做了scRNA-seq，并整合了妊娠早期肠道、儿童克罗恩病和健康回肠组织的scRNA-seq分析结果（图1.a）。数据集包含共428,000多个高质量细胞，Leiden聚类和marker-gene分析揭示了不同阶段的肠道中上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞等的比例，结果表明胎儿肠道样本富含间充质细胞和神经细胞，从妊娠中期开始，免疫细胞丰度增加（图1.b，扩图1.c-f）。

对细胞谱系的亚聚类分析，进一步识别出133种细胞类型和状态，其标记基因的表达如扩图2所示。

肠道中被报道过的BEST4上皮细胞，在不同区域的丰度也不同（图1.c-d）。差异细胞类型丰度分析揭示了它们的区域特异性表达特征（图1.e，扩展图3.a-d）。其中，小肠BEST4细胞高表达CFTR 基因（图1.e）；化学染色后发现，BEST4 细胞与杯状细胞距离非常近（扩图3.e-f）。

而进一步的功能分析发现小肠 BEST4细胞可能在杯状细胞的粘液和酸生物合成方面起着一定作用（扩图4）。

肠上皮细胞的多样性

在上皮腔室中，分泌细胞由杯状细胞、簇状细胞、Paneth细胞和微折叠细胞以及前体状态组成。

研究发现，吸收细胞和杯状细胞在所有生命阶段都表现出区域分离（图2.a-b，扩图5，扩图6.a-b）；在早期发育中，肠细胞还表达了编码跨膜丝氨酸蛋白酶的ACE2和TMPRSS2（图2.c，扩图6.c）。

肠内分泌细胞(EECs)的亚聚类结果表明，在妊娠早期的胎儿肠道中富集了表达NEUROG3的前体细胞，以及多个成熟亚群（图2.d，扩图6.d）。由NPW编码的神经肽w可刺激食物摄入并在EECs中广泛表达，作者进一步发现表达NPW的肠嗜铬细胞亚群，对PRAC1和RXFP4同样具有特异性（扩图6.d)。参与NEUROG3前体分化为肠嗜铬细胞过程的基因表达情况如图2.e以及扩图 6.e-f所示。此外，研究发现在簇状细胞中差异表达最显著的基因是PLCG2，表达与造血细胞相关的磷脂酶。通过对上游受体表达的分析，发现FCGR2A由大约2.75% 的簇细胞特异性表达（图2.f）。

PLCG2在簇状细胞中的表达水平高于B系和骨髓细胞，这一结论在体内和体外模型中均得到了证实（扩图7）。以及包括RAC2、ITPR2、PRKCA和TRPM5等下游信号介质的高表达（图2.f-h），都表明了簇状细胞对免疫细胞信号作出反应的能力。

肠道神经系统的发育

接下来，作者研究了孕后6.5周数据集中神经细胞从肠神经嵴细胞(ENCC)祖细胞分化的情况（图3.a），分别分析了早期（6-11 PCW）和晚期（12-17 PCW）的发育情况，以捕获ENCC分化的离散过程（扩图8.b）。

在早期发育中，ENCC主要通过神经目细胞分化为神经元，产生两个不同的分支：分支A和分支B（图3.a，扩图9.a-d）,在该阶段，分支A进一步分化为抑制性运动神经元（iMN）和两个具有内在初级传入神经元（IPAN）或中间神经元特征的亚群，（扩图8.d），而分支 B 进一步分化为未成熟的兴奋性运动神经元 (eMN)亚群（图3.a）。在后期发育中，分支A分化为表达NEUROD6的中间神经元，而分支B分化为IPANs (图3.b)。通过可视化，作者还观察到了SCGN (分支A1) 和GRP (分支A2和A3)以及BNC2 (分支B1和B2)在发育中和成人肌丛的相反表达(图3.c，扩图8.e)。

在6-11 PCW阶段，分化的神经元含量丰富，而发育后期则富集了神经胶质细胞，在12-17 PCW存在三种类型的肠神经和一个正在分化的神经胶质细胞亚型（COL20A1）（图3.b，扩图9.a-d）。结肠胶质细胞表达HOX基因和FAP2B，这表明它们起源于骶骨或躯干(扩图8.g)，此外，作者在肌系膜丛中观察到了BMP8B表达细胞，在肠系膜和肌肠系膜丛中均发现了DHH表达细胞(图3.d，扩图8.f)。

为了识别与巨结肠病(HSCR)相关的神经细胞，研究分析了已知的HSCR相关基因的表达，发现大多数HSCR相关基因在多个分化群体中都有不同程度的表达(图3.e)，并在神经元分支A和B之间存在差异。此外，与HSCR相关的关键配体，如GDNF, NRTN 和EDN3主要由间皮细胞、平滑肌细胞等表达(扩图8.h)。

次级淋巴器官的形成

肠道相关的淋巴组织和肠系膜淋巴结（mLN）是肠道免疫监测的关键，作者通过对胎儿和成人T细胞以及先天淋巴细胞的亚聚类，发现了三个符合淋巴组织诱导样(LTi)细胞特征的亚群（图4.a-b），它们高表达RORC, KIT, TNF等基因，缺失αβ TCR（扩图10.b-d）。

先天淋巴细胞祖细胞(ILCPs)转录水平与胎儿的肝脏ILCPs相当，在胎儿mLN和胚胎肠道中均有发现，而NCR⁺和NCR⁻3型先天淋巴细胞(ILC3s))在6-17 PCW的肠道区域大量存在，这表明LTi-like ILC3亚群在肠道相关淋巴组织的发育过程中有所扩增，在mLN的发育过程中并没有（扩图10.e-f，扩图11）。单分子荧光原位杂交(smFISH)染色识别出了所有三种LTi-like亚型（扩图10.g），并发现在近端肠道黏膜中，表达CXCR5和RORC的LTi细胞位于表达CXCL13的LTo细胞附近（图4.c）。这些结果表明ILCPs肠道发育中的第一类LTi样细胞，代表了ILC3s的祖细胞状态。

研究分别观察了动脉、静脉、毛细血管和淋巴管内皮细胞(LECs)（扩图12.a-b）， LECs分成了六个簇，标记为LEC1-LEC6（扩图12.c）。 LEC2 细胞表达淋巴结相关的TNFRSF9、THY1、CXCL5 和 CCL20等分子，以及 NF-κB通路的靶标和粘附分子，表明它们参与了淋巴细胞的运输（扩图12.d-e)。研究进一步证实，高内皮微静脉结构的存在是淋巴细胞进入以及PROX1⁺血管靠近CXCL13⁺ mLTo 和RORC⁺ LTi细胞所必需的（扩图12.f-g）。

在基质中，研究识别了肌成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞等细胞群体的亚型（图 4.d)。作者进一步识别了小鼠淋巴结中典型的成纤维细胞群，包括T网状细胞和滤泡树突状细胞；在产前肠道和mLN 中，观察到一个以表达CCL19、CCL21 和CXCL13以及NF-κB通路分子为特征的基质群（扩图13.a-f）。

然后，作者分析了控制早期白细胞招募的LEC2, mLTo和LTi-like细胞间的相互作用（扩图13.g-h），以及胎儿和成人样本之间 B 细胞活化状态的差异（扩图14)。

通过对初始免疫细胞亚群募集的可视化，该研究捕获了可能与发育中的次级淋巴器官相对应的表达mLTo标记基因（CCL19、CCL21 和 CXCL13）（扩图15.a-c）的组织区域。接下来，作者将淋巴器官的形成与在克罗恩病患者中观察到的异位淋巴结构的形成进行了比较，发现克罗恩病患者组织中的ILC3s与胎儿 NCR⁺ ILC3s的匹配率超过60%。最后，作者通过对细胞类型的全基因组关联分析，计算了与克罗恩病和溃疡性结肠炎相关基因的富集得分，发现成人的ILC3s以及胎儿的ILCPs 和 NCR⁺ ILC3s细胞富集了与克罗恩病相关的基因（图4.f，扩图15.f）。

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