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通过分析ceRNA网络来揭示与HCC预后相关的lncRNA
小编今天要为大家解读一篇关于lncRNA的文章[Comprehensive analysis of a ceRNA network reveals potential prognostic cytoplasmic lncRNAs involved in HCC progression.IF:3.923;2019.3].如今，长链非编码RNA（lncRNAs）的异常表达在肝癌（HCC）领域已经引起越来越多的关注。而lncRNA的特定功能与其细胞内位置密切相关，并且竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用主要是在细胞质，所以作者不仅分析了差异基因之间的相互作用，还分析了lncRNA的分布。这篇文章就对HCC中的lncRNA进行了详细的分析。
文章的数据与方法：
主要数据：作者从TCGA获得371例HCC组织和50例正常组织的lncRNAs，microRNAs（miRNAs）和信使RNAs（mRNAs）表达谱。
主要方法：
① 识别差异表达基因
② 构建ceRNA网路
③ 差异基因的功能通路分析
④ 生存分析
⑤ 构建风险得分系统
⑥ 单因素与多因素风险回归
⑦ 差异lncRNA与差异mRNA回归分析
主要数据和方法之后我们来看下结果
结果1：识别异常表达lncRNA，miRNA和mRNA
图1
为了进一步了解与肿瘤发展相关的DEGs，作者首先将整个样本群分为三组：一组包含50个正常样本，一个包含233个中度分化的HCC样本，另一个包含136个低分化的HCC样本。然后，如图1所示，作者将不同组进行比较，使用火山图来可视化显着差异表达的lncRNA，miRNA和mRNA。
结果2：预测靶向miRNA的lncRNA
图2
图2展示了ceRNA网络的创建流程。作者首先使用miRcode数据库预测了与753个lncRNA存在潜在相互作用的miRNA。然后，得到预测的miRNA和97个DEmiRNA之间的交集。最后，作者识别了53种具有相互作用能力的lncRNA以及13种miRNA,。
结果3：预测靶向miRNA的mRNA
为了提高生物信息学预测的可靠性，作者通过筛选三个数据库（miRDB，miRTarBase和TargetScan）共有的mRNA来识别上述13种miRNA的靶基因。然后，又将候选靶mRNA与1,535个差异表达的mRNA进行比较。最后，涉及10种miRNA和26种mRNA的miRNA-mRNA相互作用对被建立，来验证ceRNA网络。
结果4：lncRNA和ceRNA网络的细胞内定位
图3
检测lncRNA的细胞质 - 核位置是研究这些lncRNA的复杂调节机制的关键步骤，因为lncRNA的内源竞争作用主要表现在细胞质中。因此，作者用lncATLAS数据库排除了仅位于细胞核中的13个lncRNA。用Cytoscape显示所有差异表达的lncRNA的分布信息（图3a）。在考虑剩余DEG之间的相互作用后，将37个DE1ncRNA，10个DEmiRNA和26个DEmRNA整合到由73个节点和142个相互作用构成的HCC ceRNA调节网络中（图3b）
结果5：GO和KEGG 功能富集分析
图3
在这一部分作者研究了新形成的ceRNA网络中26种DEmRNA的潜在生物过程和通路，使用DAVID进行了功能富集分析，并用Cytoscape进行了可视化，如图3c所示。而图3d则揭示了KEGG功能富集中的重要通路，可以看出最显著的通路是“microRNAs in cancer”。
结果6：ceRNA网络相关基因的生存分析
图4
为了识别与HCC患者预后显著相关的差异表达基因，作者对每个基因进行了K–M生存分析以及log-rank检验。最终13种lncRNA，3种miRNA和15种mRNA被识别为致癌基因，因为这些RNA的高表达与较短的生存时间相关。此外，2个 lncRNA，CLLU1和HTR2A-AS1以及它的mRNA PROK2的表达水平与HCC患者的总体生存率正相关，表明这些RNA在HCC发展中起到保护作用。基于表达水平与HCC患者预后之间的关系排名的前3种lncRNA，miRNA和mRNA的K-M生存曲线如图4a，b和c所示。
结果7：构建lncRNA相关风险评分体系
图5
lncRNA在ceRNA网络的上游部分占主导地位，并且作为miRNA和mRNA的主要影响者起作用。此外，lncRNA的表达和分布具有高度特异性，这使其成为HCC诊断和预后评估的最佳生物标志物。因此，基于与生存率显着相关的15个lncRNA，应用lasso‐penalized Cox回归和多变量Cox回归分析来选择潜在的与预后相关的lncRNA，并且它们的贡献进行加权（图5ab）。该结果表明这些lncRNA具有保护作用，且这些lncRNA的高表达延长了HCC患者的OS（图5c），而风险得分的分布如图5d所示，患者可以根据风险得分分成两组，两组有不同的生存时间（图5ef）。图5g通过热图和散点图揭示了365名具有生存时间的HCC患者的表达谱和风险得分。在多变量Cox回归分析中，血管入侵与HCC患者的预后无关。因此，来自13个lncRNA的表达水平和病理分期的系统是HCC患者生存期的独立预后指标（图5h）。
结果8：刻画lncRNAs和mRNAs之间的相关性
图6
根据ceRNA机制，lncRNAs通过直接与miRNA相互作用调节mRNA表达。为了验证HCC中的这种现象，对与生存时间显着相关的13种风险评分相关的lncRNA和16种mRNA进行了回归分析。然后，作者研究了lncRNA和mRNA之间是否存在共有的miRNA。结果显示miR-519d是参与多种ceRNA途径的关键基因，包括AL359878.1-miR-519d-POLQ，AL359878.1-miR-519d-KIF23 ，TCL6-miR-519d-POLQ。此外，lncRNA AL359878.1通过另一种常见的miRNA miR-373与mRNA PI3K相关（图6a，b）。
到这里，文章的主要内容就介绍完了，作者整合多种数据资源以及生物信息学方法，构建出了具有预后效能的ceRNA网络，其研究思路与方法都可以借鉴。
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