口腔问题影响着越来越多的人，据统计因患牙周炎拔牙的占拔牙总数的40%左右，它还会引起口臭、牙齿脱落等症状。今天小编就给大家来分享一篇关于牙周炎的单细胞测序文章。

牙周炎免疫微环境单细胞landscape

背景

慢性牙周炎是一种由牙周组织慢性炎症组成的常见病，它是一种高度流行于人类的疾病，影响着全球约20%-50%的人口。慢性牙周炎患者通常由于局部炎症引起的破骨细胞(OC)介导的骨侵蚀增加和成骨细胞(OB)介导的骨形成减少而导致牙槽骨丢失。慢性牙周炎还容易引起系统性疾病，如心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病以及胃肠道疾病等。在牙周炎的发展过程中，大量的免疫细胞通过产生影响骨细胞的细胞因子和生长因子来激活和调节免疫反应，如破骨细胞和成骨细胞活性。免疫细胞主要包括巨噬细胞，调节性T细胞(Tregs)，TH17细胞，记忆B细胞和浆细胞等。

样本情况和研究思路

1. 样本情况：这篇文章中所用到的样本包括有4例健康对照（HCs）、5例严重慢性牙周炎(PDs)患者以及3例接受治疗后1个月内又复发的患者（PDTs）。

2. 研究思路：

本研究对三组不同来源的样本组织分别进行了单细胞测序，然后根据已知标记基因对整体数据进行分群和注释，对三个组的总体细胞类型比例进行了统计；之后再对所注释的细胞群逐一进行分析，包括再分群、注释、你时间分析、富集分析以及差异分析等。实验方面，研究人员进行了流式分选、免疫荧光等实验作为对数据分析结果的验证。

结果

1. 人牙周组织的细胞组成

在所有样本中一共捕获了51248个细胞，分别是HCs 中的14552个单细胞，PDs中含 19865个单细胞以及PDTs 中的16831个单细胞。进行UMAP分析后可以得到10个细胞类群，并根据标记基因对每一个类群进行注释，分别是T细胞、B细胞、浆细胞、内皮细胞、中心粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、肥大细胞、上皮细胞和髓系抑制性细胞（MDSCs）。同时也分析了不同类型样本中细胞类群的存在情况（图1B）以及具有代表性的标记基因在细胞群体中的表达差异情况（图1C）。此外，研究人员还比较了每个细胞类群在不同样本集中的比例（图1D），可以发现与HC组相比，PD组的T细胞群的比例显著减少，其他类型的细胞在不同样本中的比例也存在差异。

2. 成纤维细胞的异质性

成纤维细胞在调节组织稳态、协调炎症反应以及介导组织损伤等机制中都起着重要作用，所以研究人员通过UMAP进一步分析了成纤维细胞类群，得到了四大类型细胞亚群，包括六个成纤维细胞亚群、两个周细胞亚群、一个肌成纤维细胞亚群和一个增殖细胞亚群（图2A）。再对成纤维细胞亚群进一步的聚类分析发现了四个具有独特表型和功能的成纤维细胞的亚群(sCs)和三个成骨细胞谱系细胞亚群（图2B），且PD样本牙周组织中发现有大量了CXCL1+、CXCL13+和LAMP5+亚群（图2C），这三个亚群中检测到有TNFRSF21的表达。

3. 成骨细胞

在骨免疫微环境中，骨髓间充质干细胞（MSCs）具有成纤维细胞样形态，可以分化为多种细胞类型，包括成骨细胞谱系细胞。接下来，研究人员用流式分选从正常对照样本牙周组织中分离CD55+/NT5E+/LepR+或CD45-/CD55+细胞。结果表明，CD55+/NT5E+/LepR+细胞具有间充质干细胞的特性，在体外表现出多向分化的潜能（图1D）。免疫荧光分析发现，在HC样本的牙周组织中检测到在LepR+细胞类群表面CD55明显高表达，而在PD样本中，CD55+LepR+类群表达相对较低(图2E)。通过对MSCs、pre-OBs和OBs细胞类群的拟时间分析，发现了MSCs向pre-OBs和OBs进化的趋势（图2F）。同时研究人员也对三类细胞中基因的差异表达情况进行分析（图2G）以及富集分析（图2H）。

4. 周细胞

然后研究人员又对周细胞亚群进行了分析。周细胞作为壁细胞保护血管完整性，具有自我更新的特性。作为多能性成体干细胞，它们可以参与组织修复和再生的过程，并分化为多个谱系。因为缺乏特异性标记基因，所以研究人员将来自周细胞和肌成纤维细胞的单细胞数据进行合并，分析发现合并的周细胞和肌成纤维细胞一致表达RGS5，但典型的标记基因的表达情况又有不同（图3A）。通过对四个转录上不同的KCNJ8+周细胞亚群分析发现只有sC2这一类群中表达了高水平的CXCL12（血管周围MSCs的标志基因），而且这一类细胞在初始牙周治疗后仍然存在。与HC组相比，PD组的SPON2+周细胞明显上调（图3B）。

为了确定谱系关系和相应的基因表达，研究人员进行了拟时间分析（图3C）。同时也评估了在两种细胞命运中负责MSC-like周细胞分化的基因表达模式，发现COL1A1、POSTN和SPON2的表达在fate 2分支中下调，但在fate 1分支中显著上调(图3D)。与前一部分一样，研究人员也探究了其中的基因表达情况和富集情况（图3E-F）。

5. 破骨细胞

单核细胞、巨噬细胞、OCs和树突状细胞都是单核细胞，能够感知和应对炎症和骨损伤。在单核细胞群中，研究人员鉴定出了两个单核细胞群、三个巨噬细胞群、一个OCs群和DCs细胞群（图4A），并根据标记基因对这些细胞群进行注释（图4B）。与HC组相比，PD组的巨噬细胞数量显著增加，但在牙周初始治疗后有所减少（图4C）。说明初始牙周治疗可以通过抑制破骨功能有效地来防止额外的骨质流失。通过拟时间分析发现这些细胞类群在进化上并没有分支（图4D）。研究人员进一步分析了参与连续进化的基因表达模式，cluster1和cluster3的基因在破骨细胞形成过程中受到抑制，主要富集在炎症反应相关通路中（图4E-F）。同时，与免疫细胞分化相关的转录因子，如HMGB2、305 BCL6和FOS，随着分化轨迹逐渐下调(图4G)。相反，一些破骨细胞相关因子，如NFATC1、JUN、MAFB、JDP2在此过程中上调(图4G)。此外，IL1B和CCL20在巨噬细胞中表达量高，而在破骨细胞生成中表达量降低(图4H)。

6. 内皮细胞

由于炎症浸润增强，牙周病变中可见大量内皮细胞(图1D)。研究人员从4461个内皮细胞中鉴定了10个不同类型的内皮细胞群(图5A)。静脉内皮细胞和动脉内皮细胞的相对百分比在PD组高于HC组，而PDT组与PD组相比没有显著差异。PD组的淋巴ECs也有类似的变化情况，尽管并没有统计学上的显著差异(图5A-C)。研究人员还对ECs中的转录因子进行了分析（图5D-E），发现SOX17和TEAD3可能参与体内平衡和炎症条件下动脉再生，可能与牙周微环境中动脉ECs的改变相关。差异分析发现，在PD vs HC，PDT vs PD 以及PDT vs PD这几种情况下，CSF3都处于上调状态（图5F）。

7. T细胞和B细胞在牙周组织微环境中的异质性

免疫细胞是慢性炎症的重要调节因子，于是研究人员最后对免疫细胞这一类群进行的探究，包括T细胞、B细胞以及浆细胞（图6A）。首先是对这些亚群进行分群聚类和标记基因注释（图6B），从中识别出了NKT细胞、CD4+细胞、CD8+细胞。然后又从CD4+细胞群和CD8+细胞群中分别聚类出六个CD4+系细胞亚群和七个CD8+系细胞亚群（图6C-D）。之后便是富集分析，比较了不同组别样本之间富集通路的差异（图6E），此外，还在CD8+细胞亚群中检测到了关键免疫检查点基因（图6F）。分析完T细胞，研究人员又对B细胞也进行了一系列分析（图6G-J），包括分群、注释以及富集分析等。

8. 细胞通讯

逐一对所关注的细胞类群进行分析后，研究人员还进行了细胞通讯分析（图7），因为研究骨细胞与免疫细胞之间的相互作用有助于进一步了解牙周炎的发病机制。因此他们采用CellPhoneDB识别主要细胞类型中的受体-配体对，共识在HC、PD和PDT组的样本中鉴定了91699对配体-受体相互作用对。

正如图8所示，牙周治疗后牙周组织中骨免疫细胞之间存在相互作用调节网络。

小结

本文主要是通过单细胞测序技术从单细胞层面对牙周炎免疫微环境中不同类型的细胞类群逐一进行分析。整体思路比较简单，概括来说就是分群，注释，然后是对注释完的细胞亚群进行再聚类和分析，最后是对不同类型的细胞进行了细胞通讯分析。当然，这篇文章并不是纯数据分析，其中也做流式和荧光染色等这些实验。但是其中对于单细胞数据分析的思路也是值得我门借鉴的。

参考文献

Yue Chen, Hua Wang, Wen Sun. Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis.