今天跟大家分享的是十月份发表在Clinical Cancer Research杂志（IF：10.107）上的一篇文章，文章主要讲的是本工作基于TCGA的HNSCC的RNA-seq数据集和免疫基因集，通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)识别了22个免疫相关的bub基因。通过Cox回归分析构建免疫相关遗传预后指数(IRGPI)，并使用GEO数据集验证。随后，分析了在IRGPI定义的亚组中，ICI治疗的分子和免疫特性以及益处。

An immune-related gene prognostic index for head and neck squamous cell carcinoma

头颈部鳞状细胞癌的免疫相关基因预后指标

一、摘要

免疫检查点抑制剂（ICI）治疗是一种很有前景的肿瘤治疗方式，但ICI治疗有一定的局限性，比如患者响应率低，自付医疗费用高。本工作的目的是全面了解头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤微环境，并找到一个有价值的生物标志物来预测HNSCC患者对免疫治疗获益。在本研究中，开发了一种免疫相关遗传预后指数（IRGPI），并分析了其在区分不同的分子和免疫特征以及HNSCC预后中的作用。多组学数据综合分析显示，IRGPI-high的患者免疫反应活跃，肿瘤表型侵袭性较低，总体生存时间较长，ICI治疗获益更多，而IRGPI-low的患者则相反。IRGPI作为一种免疫相关的预后标志物，可能会对HNSCC的免疫治疗策略产生一些潜在的影响。

二、数据及方法

1.数据

（1）TCGA的546个HNSCC样本，包括502癌症样本和44个癌旁样本的RNA-seq和临床病理信息。Vonn Andrew Walter和Pierre Saintigny提供502个HNSCC样本的分子亚型。由Yu-Pei Chen（中国中山大学癌症中心）提供502例HNSCC标本的免疫亚型。

（2）GEO数据库的270 个HNSCC样本的RNA-seq数据和生存信息（GSE65858）。

（3）ImmPort和InnateDB数据库的免疫相关基因。

（4）RAID 2.0、TRRUST v2和STRING下载mRNA与转录因子（TFs）、以及miRNA和lncRNA关系数据。cBioPortal下载基因突变数据

2.方法

（1）识别免疫相关的hub基因

用limma包对TCGA的HNSCC样本的RNA-seq数据进行分析，识别癌症vs正常的差异基因。对免疫相关的差异基因使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析。

然后使用WGCNA来识别hub基因。首先计算两个基因表达之间的Pearson相关系数，构建相似度矩阵。然后将相似度矩阵转化为邻接矩阵，使用拓扑重叠测度（TOM）将矩阵转化为拓扑矩阵。接着以1-TOM作为基因聚类距离，构建动态剪枝树进行模块识别。然后基于显著相关模块的基因，利用两个基因之间的边的权重> 0.2的基因构建网络。网络中度排名前50的基因定义为hub基因。通过R包maxstat获得每个hub基因对总体生存（OS）的最佳阈值，并选择22个显著生存相关免疫相关hub基因进行进一步分析。

使用R包ComplexHeatmap分析了22个免疫相关hub基因的体细胞突变。分析了这些基因在TF、miRNA和lncRNA调控网络中的作用。使用Cytoscape软件对网络中的基因进行KEGG通路分析进行可视化。

（2）IRGPI的构建与验证

在22个免疫相关hub基因中筛选出显著影响OS的基因，通过多变量Cox回归分析构建IRGPI。每个样本的IRGPI是通过将某些基因的表达值乘以它们在Cox模型中的权重，然后相加得到。使用K-M生存曲线和log-rank检验来评估IRGPI的预后能力。

（3）综合分析不同IRGPI亚型的分子和免疫特性及ICI治疗

首先对IRGPI评分高（n = 251）和低（n = 251）的样本中的所有基因用R包limma进行差异表达分析。然后使用R包clusterProfiler进行基于KEGG和HALLMARK基因集的基因集富集分析（GSEA）来确定差异表达基因参与的信号通路。然后用R包GSVA对几个代表性基因集进行单样本GSEA（ssGSEA）分析，并分析生存差异。

使用R包Maftools分析两个IRGPI亚型基因突变的数量和质量。对IRGPI分数与PD-L1表达及总突变负荷（TMB）进行相关分析。使用CIBERSORT 评估502个HNSCC样本的22种免疫细胞的相对比例。然后比较两组IRGPI亚型中22种免疫细胞和临床病理因素的相对比例。

对两组接受抗PD-L1治疗的尿路上皮癌（UC）患者进行了生存分析。使用R包timeROC进行了时间依赖性ROC曲线分析，比较IRGPI、TIDE和TIS的预后价值。TIDE score是在线计算。T-cell-inflamed signature （TIS） score以18个特征基因log2-scale标准化表达的平均值计算。

（4）统计分析

采用T检验进行两组间连续变量的比较，使用卡方检验分析分类数据，使用Wilcoxon检验对两组间TIDE评分进行比较。使用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验进行单因素生存分析。采用Cox回归模型进行多因素生存分析。认为双侧P< 0.05是显著的。

三、结果解析

1.免疫相关hub基因

与正常样本相比，肿瘤样本中差异表达基因3877个。将这些基因与从ImmPort和InnateDB获得的免疫相关基因列表交叠，得到1131个差异表达的免疫相关基因，在肿瘤样本中有860个基因表达上调，271个基因表达下调。然后对基因进行功能富集分析。

通过基于average linkage层次聚类和最优软阈值，将1131个基因分配到7个模块。根据每个模块中模块与样本特征之间的Pierson相关系数，发现蓝色和蓝绿色模块与HNSCC肿瘤密切相关，选择这些模块中的基因进行进一步富集分析。获得了度排序前50个免疫相关hub基因。KM分析发现，22个免疫相关的hub基因表达与HNSCC患者OS密切相关。

然后分析了22个免疫相关hub基因的特征，发现大部分发生了扩增、深度缺失和错义突变。接下来分析了hub基因与miRNAs和TFs、miRNAs与lncRNAs的互作情况。去除冗余后，网络中共有118对相互作用，涉及77个基因。接下来通过使用Cytoscape的ClueGO plugin功能，对调控网络中的基因进行KEGG通路富集分析，发现它们在与糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、癌症的转录错调和调节长寿的通路中显著富集。

2. 不同IRGPI组的生存结果

为了确定独立的预后基因，对22个免疫相关的hub基因进行了OS的多变量Cox回归分析。如图1A和1B所示，只有3个基因（SFRP4、CPXM1和COL5A1）显著影响HNSCC患者的OS。接下来构建预后指标，单因素Cox回归分析显示TCGA数据中年龄、IRGPI、HPV状态和分期与HNSCC的预后显著相关。多因素Cox回归分析证实在校正其他临床病理因素后，IRGPI是独立的预后因素（图1C）。然后以中位IRGPI值为阈值，发现IRGPI高的患者效果更好（图1D）。接下来使用GSE65858 （n = 270） HNSCC数据集验证IRGPI。如图1E所示，IRGPI-high亚组患者的预后明显优于IRGPI-low亚组患者，与TCGA数据集结果一致。

图1.不同IRGPI亚型的预后分析

3. 不同IRGPI分型的分子特征

首先通过GSEA分析不同IRGPI亚型中富集的基因集。IRGPI-high样本的基因集中富集于DNA修复和免疫应答相关通路（图2A），而IRGPI-low 样本的基因集中富集于癌症和肿瘤转移相关通路（图2B）。为了进一步了解IRGPI亚型的免疫学性质，接下来分析了基因突变情况。发现IRGPI-high亚组的突变数量明显高于IRGPI-low亚组。最常见的突变类型是错义变异，其次是无义和移码缺失。接下来确定了IRGPI亚型中突变率最高的10个基因（图2C）。接下来，分析了IRGPI评分与PD-L1表达及TMB之间的关系。结果显示，IRGPI评分与TMB的相关性较小，而IRGPI评分与PD-L1无显著相关性。

图2.不同IRGPI亚型的分子特征

4.不同IRGPI亚型的免疫特性

为了分析不同IRGPI亚型中免疫细胞的组成，采用Wilcoxon检验比较不同IRGPI亚型中免疫细胞的分布。发现在IRGPI-high亚型中，CD8 T细胞等细胞显著富集，而在IRGPI-low亚型中，naïve B细胞等细胞富集（图3A）。图3B显示了与免疫景观相关的特征，包括不同IRGPI亚型的临床病理特征。接下来发现在IRGPI-high亚组中，CD8 T细胞、MHC I类、损伤修复细胞较多，而在IRGPI-low亚组中有更多的免疫抑制细胞和信号以及肿瘤和转移相关信号。

然后研究了是否IRGPI的预后价值来自于更好的免疫控制或较低的肿瘤侵袭性。可以发现上皮-间充质转化、TGF -和WNT -相关信号得分较高的患者，有更差的预后，而具有更多P53突变、CD8 T细胞和巨噬细胞M1的患者有更好的预后。因此，认为IRGPI的预后价值可能来自更好的免疫控制和较低的肿瘤生长侵袭性。

图3. HNSCC的TME景观及不同IRGPI亚型的特征

5. IRGPI分型与其他免疫和分子亚型的关系

有一个根据肿瘤和间质室的组成不同对HNSCC进行免疫分型，总结出三种免疫亚型：非免疫亚型、免疫衰竭亚型和免疫激活亚型。从图4A中可以发现，非免疫样本的比例在IRGPI两组之间几乎是均等的，但是在IRGPI-high组相较于IRGPI-low组，免疫活性样本较多，免疫衰竭样本较少。然后将203个免疫样本按照已有研究的一个pan-SCC免疫亚型进一步分类。如图4B所示，其中IRGPI-low组中IS1和IS5亚型较多，IRGPI-high组中IS4亚型较多。

在大规模的HNSCC基因组分析研究中，有四种不同的分子亚型经常被报道，即atypical、basal、classical和mesenchymal。接下来着重研究了IRGPI组中分子亚型的分布。发现IRGPI-low亚组包括16%的atypical型样本，22%的basal型样本，19%的classical型样本和43%的mesenchymal型样本，而IRGPI-high亚组包括36%的atypical型样本，37%的basal型样本，15%的classical型样本和13%的mesenchymal型样本（图4C）。classical型在两组间几乎均匀分布，但IRGPI-high亚组atypical型和basal型样本多于IRGPI-low亚组，mesenchymal型较少。

图4. 不同IRGPI亚型的免疫和分子亚型分布及ICI治疗的免疫应答

6. 不同IRGPI亚组的ICI治疗疗效

接下来使用TIDE方法评估免疫治疗在不同IRGPI亚型中的潜在临床疗效。TIDE预测得分越高，表示免疫逃避的可能性越高，说明患者从ICI治疗中获益的可能性越小。结果发现IRGPI-high组的TIDE评分低于IRGPI-low组，说明IRGPI-high患者比IRGPI-low患者更能从ICI治疗中获益（图5A）。同时，发现IRGPI-high亚组有较高的微卫星不稳定性（MSI）评分，而IRGPI-low亚组有较高的T细胞exclusion评分，但在T细胞功能障碍方面两亚组无差异。此外，还评估了anti-PD-L1 治疗的两组UC患者中IRGPI的预后价值。从图5B和图5C可以看出，IRGPI-high患者比IRGPI-low患者的OS更好。发现TIDE在Alexandra et al’s UC 样本和Mariathasan et al’s UC 样本中的表现不一致（图E），TIS组在12个月和18个月的随访中AUCs更好，IRGPI组在18个月和24个月的随访中AUCs更好。因此，认为在两个组中，IRGPI对OS的预测价值与18-gene TIS 和TIDE相当。

图5. IRGPI对抗PD-L1治疗患者的预后价值

总结：

本工作是通过对TCGA的HNSCC的肿瘤和正常样本进行差异表达分析，得到差异基因后再与免疫相关基因做交叠，然后用交叠后的基因进行WGCNA分析识别了22个免疫相关的bub基因。然后通过COX回归识别3个基因特征并基于此构建免疫相关基因预后指数（IRGPI），发现IRGPI-high亚组患者的预后优于IRGPI-low亚组。接下来对IRGPI的分子和免疫结构进行了分析，识别了两组样本显著富集的通路、突变景观差异，并分析了IRGPI亚型中免疫细胞的组成，发现IRGPI的预后价值可能来自更好的免疫控制和较低的肿瘤生长侵袭性。然后分析了IRGPI分型与其他免疫和分子亚型的关系，以及不同IRGPI亚组的ICI治疗疗效。