细胞死亡的方式一直以来都是生物医学领域的研究热点，关于细胞凋亡、细胞自噬、细胞坏死已经有了大量作者进行研究了，其中铁死亡无疑是近年来生物科学领域TOP 10热点前沿，且相关研究多次产出高分文章。铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化引发的新型细胞死亡方式，更重要的是，铁死亡被发现其在肿瘤细胞中发生，并且在癌症免疫中发挥作用，这意味着铁死亡还能与目前最热门的癌症治疗—免疫治疗攀上关系，两大热点相互碰撞，很难不火！下面就让跟着小编一起解读一篇刊登在Cell Metabolism (IF=27.287) 上的文章吧。

一、研究背景

目前免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂、双特异性抗体、抗体药物偶联物（ADC）、CAR-T治疗四大类型，都依赖于强效抗肿瘤T细胞对癌细胞的靶向破坏。其中，利用免疫检查点抑制剂(ICB)增强内源性抗肿瘤反应和通过过继细胞治疗给药特异性抗肿瘤免疫细胞的癌症免疫治疗在治疗多种恶性肿瘤方面取得了前所未有的成功。但是其中一个主要问题是CD8+ T细胞在遇到免疫抑制肿瘤微环境(TME)时功能失调。

TME中有多种免疫细胞浸润, 其中CD8+ T细胞由于具有杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞等细胞毒性能力，通过调节CD8+T 细胞的代谢，恢复和增强肿瘤环境中异常的CD8+T 细胞的功能是免疫治疗中的一个热点研究对象。

该研究揭示了CD36调节CD8+效应T细胞功能的新机制，以及靶向CD36或抑制铁死亡恢复T细胞功能的治疗潜力。

二、结果

1、在人类癌症中，肿瘤浸润性CD8+ T细胞的CD36表达与肿瘤进展和低生存率相关

作者使用 独创性通路分析（IPA）对黑色素瘤患者的CD8+T细胞进行分析时，发现来自长期存活患者的肿瘤浸润性 CD8+ T细胞显着上调了 LXR /RXR 和 PPARa/RXRa 以及下调 TREM1 信号通路（图1A），在这些信号通路下游分子CD36 被下调。此外，通过RNA-seq数据进行分析，与无反应者相比，对 PD-1 有反应的患者表现出最显着的 LXR/RXR 激活信号通路上调，并且 CD36 在该通路中被下调，故CD36 表达与患者预后之间呈负相关。

进一步分析黑色素瘤患者的CD8+T细胞中脂质代谢相关基因的表达发现，发现在存活周期长的病人中，CD8+T细胞的CD36表达更低。（图1B）。与来自MM（多发性骨髓瘤） 患者的细胞相比，来自MGUS (单克隆丙种球蛋白病) 患者的CD8+ T 细胞的 CD36 表达较低（图1C）。MM 患者的骨髓（肿瘤床）和外周血相比，骨髓中的 CD8+ T 细胞比外周血中的 CD8+ T 细胞有更高的 CD36 表达（图1D）。

综上所述，由肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞中 CD36 表达的增加与人类肿瘤进展和低生存率有关。

2、肿瘤浸润 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达随着肿瘤进展而上调，而CD36 缺乏导致小鼠癌症中更好的抗肿瘤反应。

为了确定CD36 在肿瘤浸润 CD8+ T 细胞上的表达和作用，作者使用小鼠黑色素瘤（B16）和小鼠 MM 构建 Vk*MYC 模型。研究发现肿瘤浸润 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达随着B16 肿瘤的体积的增大及Vk*MYC 肿瘤中M-spike条带强度的增加而上调（图1E-F），而不同时间点 CD4+ T 细胞上 CD36 的表达没有变化。结果表明，在小鼠肿瘤模型中，肿瘤浸润 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达与肿瘤进展呈正相关。

先前的研究表明，TME中的胆固醇诱导CD8+ T细胞功能衰竭，抑制胆固醇代谢可增强CD8+ T细胞抗肿瘤功能，因此为了确定 TME 中的胆固醇是否导致肿瘤浸润 CD8+ T 细胞中 CD36 表达的上调，如果是，那么CD8+ T 细胞上的 CD36 表达是否影响其抗肿瘤功能。作者使用 bCD（β-环糊精）来消耗 TME 中的胆固醇，发现胆固醇直接诱导 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达（图 1H），其次，与野生型 (WT)小鼠相比，CD36 缺陷型 (CD36^-/-)小鼠中 B16 肿瘤的生长速度较慢，并且荷瘤 CD36^-/- 小鼠的存活时间比 WT 小鼠长。然而，当这些小鼠中的 CD8+ T 细胞耗竭时，两种小鼠之间肿瘤生长和小鼠存活率差异就消失了。

综上所述，TME 中的胆固醇诱导CD8+ T 细胞上的 CD36 表达随着肿瘤进展而上调，且影响CD8+T细胞的抗肿瘤作用。

3、在人和小鼠CD8+ T细胞中，CD36的表达与细胞毒性细胞因子的产生减少和抗肿瘤活性受损有关

由于CD8+ T 细胞上的 CD36 表达与抗肿瘤功能减弱和预后不良有关，故作者探究了CD8+ T 细胞中 CD36 与细胞毒性细胞因子相关基因表达之间的关系，结果表明，CD36 在CD8+ T 细胞上的表达与许多细胞毒性细胞因子相关基因的表达及其转录因子（如 IFNG、PRF1、GZMB 和 TBX21）呈负相关（图 2A）。

其次，2周皮下(s.c)生长的B16肿瘤中CD8+ T细胞与1周肿瘤T细胞相比具有更低的IFNγ和TNFα产量(图2B)。由此作者进一步检查了来自皮下的 T 细胞 IFNγ 和 TNFα 的产生，发现与来自 WT 小鼠的 T 细胞相比，来自 CD36-/- 小鼠的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞具有更高的 IFNγ 和 TNFα 产量以及更高的增殖率（图 2C），表明肿瘤内 CD8+ T 细胞携带 CD36-/- 的小鼠比WT 小鼠具有更强的效应功能。

紧接着，作者想探究CD36缺乏是否也会影响CD4+ T细胞功能。因此作者检测到CD4+ T细胞中IFNγ、TNFα、Gzmb和穿孔素的产生，发现IFNγ和TNFα的增加及Gzmb和穿孔素的产生与肿瘤浸润的CD4+ T细胞没有显著性影响，故CD36缺乏主要影响CD8+效应细胞功能，而非CD4+效应细胞功能。

为了证实上述结果，作者对B16肺转移瘤模型及Vk*MYC模型中的T细胞进行了研究。结果表明，来自CD36-/- 小鼠的肺(肿瘤床)、脾脏、引流淋巴结和淋巴结的CD8+ T细胞与对照小鼠相同器官的T细胞相比有更高的IFNγ和TNFα生成(图2F-2H)。并且与对照小鼠相比，CD36-/-小鼠的肿瘤灶更少(图2I)。这些结果表明，CD8+ T细胞表达CD36可抑制其细胞毒性细胞因子的产生，抑制其抗肿瘤功能。

更进一步，作者将肿瘤特异性T细胞转移到B16肺转移和皮下生长的B16肿瘤模型中。与Pmel-1 WT CD8+ T细胞相比，过继转移Pmel-1 CD36-/-CD8+ T细胞在B16荷瘤小鼠肺、脾脏和淋巴结中有更高的IFNγ和TNFα生成，且具有更好的抗肿瘤功能和延长小鼠生存期。

综上所述 ，CD36会影响CD8+T细胞分泌杀伤性的细胞因子，从而影响CD8+T细胞的抗肿瘤作用。

4、CD36 表达与小鼠和人肿瘤浸润 CD8+ T 细胞中脂质过氧化和铁死亡的激活有关

为了阐明 CD36 介导的 CD8+T 细胞中细胞毒性细胞因子产生抑制的机制，作者分析了来自 WT 和 CD36^-/- 小鼠的内源性肺转移 B16 肿瘤浸润 CD8+T 细胞的 RNA-seq 数据，分析结果表明sirtuin 途径被激活，氧化磷酸化途径被下调（图 3A）。使用对代谢相关通路的通路富集分析（图 3B）时发现，与 WT CD8+ T 细胞相比，CD36^-/- CD8+ T 细胞可能具有更低的氧化应激、更少的 ROS 产生和更少的氧化应激诱导的细胞死亡。

脂质过氧化是脂质受到氧化剂攻击的过程，可以由氧化应激和 ROS 诱导，而铁死亡是一种由脂质过氧化引起的细胞死亡。基于上述多途径分析的结果，作者推测 CD36^-/- CD8+ T 细胞可能比 WT CD8+ T 细胞具有更低的脂质过氧化，并假设 CD36^-/- CD8+ T 细胞的铁死亡水平低于 WT CD8+ T 细胞。通过RNA-seq 数据分析和富集分析（图 3C-D）得出，CD36的表达与脂质过氧化和铁死亡密切相关，且CD36^-/- CD8+ T 细胞与脂质过氧化或铁死亡激活相关的基因表达较低且在肿瘤浸润 CD8+ T 细胞中的富集较少。

为了证实CD36 表达会诱导CD8+ T 细胞中脂质过氧化和铁死亡的激活的临床相关性，作者进行了以下分析（图3E-K）：

首先，对黑色素瘤患者肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞进行单细胞测序数据和基因表达富集分析，发现患者肿瘤浸润性 CD36 表达高的CD8+ T 细胞对参与细胞对 ROS 和氧化应激反应的信号通路有更高的激活，且具有与更高水平的脂质过氧化和铁死亡以及降低的细胞毒性功能相关的基因表达模式。

紧接着，使用脂质过氧化检测试剂盒和细胞死亡率来评估细胞中铁死亡的水平，发现来自 CD36^-/- 小鼠的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞脂质过氧化、细胞死亡率、铁水平及细胞溶质 ROS 水平均比WT小鼠低。过继转移的肺和皮下生长的 B16 肿瘤模型的肿瘤浸润 Pmel-1 CD36^-/- CD8+ T 细胞相比于Pmel-1 WT CD8+ T也有同样的结果。

5、CD36 介导的铁死亡是导致小鼠和人 CD8+ T 细胞中细胞毒性细胞因子产生减少的原因

为了确定 CD36 介导的铁死亡是否导致CD8+T 细胞中细胞毒性细胞因子的产生减少，作者做了如下工作：

首先分析了皮下生长的 B16 肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的脂质过氧化。将肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞分为 CD36high 和 CD36low 群体，并观察到肿瘤浸润的 CD36high CD8+ T 细胞比 CD36low CD8+ T 细胞具有更高的脂质过氧化和铁死亡（图4A-B）。

其次，分析了 1 周和 2 周皮下生长的 B16 肿瘤的肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞，并发现与来自 1 周肿瘤的 T 细胞相比，具有高 CD36 表达的 2 周肿瘤浸润 CD8+ T 细胞具有显着更高的脂质过氧化和铁死亡（图4C-D）。此外，与脾脏 CD8+T 细胞相比，B16 肿瘤浸润 CD8+T 细胞具有更高水平的 CD36 表达、脂质过氧化、细胞死亡、铁死亡和细胞溶质 ROS（图 4E-4G）。

这些结果表明 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达与其在 TME 中的铁死亡诱导呈正相关。

紧接着，在存在肿瘤的情况下培养 CD8+ T 细胞显着上调 CD36 表达并诱导脂质过氧化并抑制 T 细胞中的 IFNγ 和 TNFα 产生（图4H-J），使用 CD36-/- CD8+ T 细胞来进一步确定 CD36 在肿瘤诱导的脂质过氧化、铁死亡以及 CD8+ T 细胞中 IFNγ 和 TNFα 生成减少中的作用。与肿瘤治疗的 WT CD8+ T 细胞相比，肿瘤治疗的 CD36-/- CD8+ T 细胞具有更低的铁死亡水平和更高的 IFNγ 和 TNFα 产量（图4K-M），表明 CD8+ T 细胞的 CD36表达 负责诱导肿瘤的脂质过氧化、铁死亡，并导致细胞毒性细胞因子的产生减少。

此外，研究表明，添加铁死亡抑制剂 (ferrostatin-1) 可部分消除肿瘤诱导的铁死亡并恢复细胞中 IFNγ 和 TNFα 的产生，表明 CD36 介导的铁死亡抑制 CD8+ T 细胞毒性细胞因子产生。从 Vk*MYC 肿瘤模型和 MM 患者中获得了类似的结果（图4N-R）。

最后，为了进一步确定这些发现是否与人类癌症相关（图4T-V），作者添加MM患者骨髓血浆的人CD8+ T细胞培养显着上调CD36表达，并诱导脂质过氧化和铁死亡以抑制T细胞中细胞毒性细胞因子的产生。此外，CD36 阻断抗体或添加铁死亡抑制剂 (ferrostatin-1) 可部分消除肿瘤诱导的铁死亡并恢复细胞。 

6、CD36 介导铁死亡并通过小鼠和人类 CD8+ T 细胞中的脂肪酸摄取减少细胞毒性细胞因子的产生

为了阐明 CD8+ T 细胞中 CD36 介导的铁死亡的潜在机制，在皮下生长或肺转移的 B16 肿瘤模型中，发现肿瘤组织的脂肪酸含量高于正常皮肤或脾脏，转移的肺组织的脂肪酸含量高于正常肺。在 Vk*MYC 肿瘤模型中，与正常骨髓相比，携带 MM 的骨髓具有更高的脂肪酸含量（图5A-C）。
由于铁死亡主要是由于细胞内的脂质过氧化物的堆积引起的，及 CD36可通过摄取肿瘤环境中的脂肪酸，因此作者推测通过 CD36 摄取脂肪酸会诱导 CD8+ T 细胞铁死亡，导致细胞毒性细胞因子产生减少。为了验证这一假设，其进一步研究了脂肪酸混合物对 CD8+ T 细胞铁死亡和细胞毒性细胞因子产生的影响（图5D-J），发现脂肪酸诱导的 CD8+ T 细胞铁死亡。铁死亡诱导剂（RSL-3 和 Fin56）用作阳性对照，并显著诱导 CD8+ T 细胞铁死亡。脂肪酸、RSL-3 和 Fin56 均显著抑制 CD8+ T 细胞毒性细胞因子的产生。添加铁死亡抑制剂 ferrostatin-1、SRS16-86 或 liproxstatin-1 可挽救脂肪酸诱导的铁死亡，并恢复 T 细胞中 IFNγ 和 TNFα 的产生。在人类 CD8+ T 细胞中也观察到了类似的现象。
其次，我们检查了 CD36 在 CD8+ T 细胞脂肪酸摄取、铁死亡激活和细胞毒性细胞因子产生中的作用。我们观察到（图5N-T），与 WT CD8+ T 细胞相比，CD36-/- CD8+ T 细胞的脂肪酸摄取较少，并表现出较少的铁死亡并产生更多的 IFNγ 和 TNFα。
这些结果证实了上述假设，即肿瘤组织富含脂肪酸，并且脂肪酸诱导 CD8+ T 细胞铁死亡和效应子功能的丧失。 
此外，作者分析了肿瘤处理的 CD36-/- CD8+ T 细胞和 WT CD8+ T 细胞中的脂肪酸组成。结果表明，只有 AA（u-6 多不饱和脂肪酸的代表） 在 WT CD8+ T 细胞中诱导脂质过氧化和铁死亡、细胞溶质 ROS 水平的增加，并减少细胞毒性细胞因子的产生，但在 CD36-/-  CD8+ T 细胞中不诱导。
综上所述， CD36通过摄取肿瘤环境中的脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪-花生四烯酸，导致了CD8+T细胞内脂质过氧化物的堆积，铁离子含量升高，铁死亡过程增多，杀伤性的细胞因子分泌减少。

7、靶向铁死亡或 CD36 增强 CD8+ T 细胞和基于 ICB 的肿瘤免疫治疗

为了研究 CD8+ T 细胞中铁死亡的水平是否影响其抗肿瘤功能，作者比较了对照、铁死亡诱导剂 RSL-3-、脂肪酸或铁死亡抑制剂 ferrostatin-1 处理的荷瘤小鼠 CD8+ T 细胞的抗肿瘤作用。

结果表明，过继转移后，小鼠外周血检测到的CD8+ T细胞的数量的关系为ferrostatin-1 > 对照组 > 铁死亡诱导剂 RSL-3-、脂肪酸。同样的，注入 ferrostatin-1 处理的 CD8+ T 细胞的小鼠在所有组中显示出更低的铁死亡和更高的 IFNγ 产生和增殖，以及最小的肿瘤负荷和最佳的存活率，而脂肪酸或 RSL-3 处理的 CD8+ T 细胞在小鼠中发挥受损的抗肿瘤作用。 此外，为了进一步确定临床治疗效果，当 CD36-/- CD8+ T 细胞与抗 PD-1 抗体结合进行联合免疫治疗，能获得了更好的抗肿瘤效果并延长了小鼠存活时间或单独的 PD-1 抗体。

综上所述，通过阻断CD36的表达，或者添加铁死亡的抑制剂，可以显著减少CD8+T细胞内脂质过氧化物的含量，增加杀伤性分泌分子的表达，可以显著延长CD8+T细胞在体内的存活时间，增强体内抗肿瘤功能，即通过阻断 CD8+ T 细胞上的 CD36 可增强基于 ICB 的免疫疗法。

四、讨论

这篇铁死亡+免疫治疗的套路总结如下：

首先，探究在肿瘤进展中与CD8+ T细胞相关的表达与作用，进而得出TME 中的胆固醇诱导CD8+ T 细胞上的 CD36 表达升高与肿瘤进展和低存活率呈正相关。进一步研究得出CD36会影响CD8+T细胞分泌杀伤性的细胞因子，从而影响CD8+T细胞的抗肿瘤作用。

紧接着，探索CD36如何调节CD8+T细胞功能的机制研究，得出CD36的表达与脂质过氧化和铁死亡密切相关。

进而确定 CD36 介导的铁死亡是否导致CD8+T 细胞中细胞毒性细胞因子的产生减少，如果是，则其抑制的机制是什么？得出CD36通过摄取肿瘤环境中的脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪-花生四烯酸，导致了CD8+T细胞内脂质过氧化物的堆积，铁离子含量升高，铁死亡过程增多，细胞毒性细胞因子分泌减少。

最后，为了进一步贴合临床治疗效果，研究人员对黑色素瘤负荷小鼠进行免疫治疗。结果表明通过外源输入CD36缺失的CD8+T 细胞， 结合PD1的联合免疫治疗，显著增强了CD8+T细胞的抗肿瘤作用。