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最近小编发现，除了肿瘤分型，基因集、明星通路、热点表型建模外，既往被高强度研究过的癌基因还有巨大的挖掘价值。今天就给大家带来一篇以Ras相关蛋白为主角的生信meta研究，并非常规的生信套路文章，研究思路设计严谨，这就给各位解读一下！
文章“Identification of RASSF1A promoter hypermethylation as a biomarker for hepatocellular carcinoma”发表在《Cancer Cell Int》，影响因子6.26分。
背景介绍:
RAS相关区域家族1A（RAS association domain family 1A, RASSF1A）是近年来新发现的一个候选肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG），该基因的失活在多种人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用。虽然基因缺失和点突变可引起基因的失活，但大量研究表明，该基因的失活与其启动子高甲基化有关。这种表观遗传学机制可使多种抑癌基因失活，并被证实为肿瘤发生发展的主要原因。
结果展示：
Screening of studies
文献筛查
首先制定文献检索策略：search strategy of (HCC OR hepatocellular carcinoma OR liver cancer) AND (hypermethylation OR methylation OR epigenetics) AND (RASSF1A or RASSF1 or Ras association domain family 1 A)
经过文献检索，作者初步纳入479篇研究(图1)，首先排除重复文献208个，排除与研究内容无关文献的218个。此外，有15个研究观测指标与作者研究内容不相关被排除。最后，共计44个研究负荷作者的研究主题：12项研究提供了肝癌的RASSF1A启动子甲基化频率数据，并评估了这种甲基化与临床病理特征的相关性。29项研究仅提供了肝癌患者的RASSF1A启动子甲基化频率，3项研究仅提供了肝癌患者的临床病理特征。
Characteristics of the enrolled articles
纳入文献的基线资料
入选研究的特征如表1所示。研究年限从2002年到2019，共计44项病例对照研究，包含4777名肝癌患者。纳入研究的地域较广，有28篇文章来自亚洲。8篇文献来自美国，其次是非洲(n = 5篇)，意大利和德国各发表一篇。检测样本主要有三种来源，包括组织(n = 31)、外周血(n = 11)以及组织和外周血同时调查(n = 2)。在入组的研究中，肝癌患者为病例组，正常样本为对照组，并被分配到非肿瘤组和正常组。在评估肝癌诊断效率的研究中，采用血液（n=11），采用组织（n=31），同时检查了血液和组织（n=2）。采用异质性检验评估入组研究中RASSF1A的甲基化状态。采用Newcastle-Ottawa scale (NOS) 评估41个报道病例和对照组RASSF1A甲基化频率的研究质量。评分范围5 - 8分，表明具有相对较高的质量。另外3项研究仅报道肝癌的床病理特征，未进行评估。
Effect of RASSF1A promoter hypermethylation on HCC in the pooled analyses
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and non-tumor groups
汇聚分析RASSF1A启动子高甲基化对肝癌的影响
比较肝癌组与非肿瘤组RASSF1A启动子甲基化状态
作者汇聚了34研究，涉及2075名肝癌样本和2276名非肝癌样本。通过meta分析评价RASSF1A基因启动子上甲基化与肝癌发生率的关系(图2)。作者发现RASSF1A基因启动子甲基化频率与较高的患肝癌风险相关, (odds ratio [OR] = 6.87, 95% confidence interval [CI] = 4.98–9.50, P < 0.001)，结果异质性中等(I 2 = 64.1%, P = 0.000)。
作者进一步按样本类型(血液和组织)、检测方法和样本大小对纳入研究进行亚组分析，探索可能的异质性来源。亚组分析显示，RASSF1A基因启动子高甲基化与患肝癌风险显著相关(blood: OR = 6.93, 95% CI = 4.12–11.65, P < 0.001; tissue:OR = 7.12, 95% CI = 4.78–10.59, P<0.001)。此外，在检测方法的亚组分析中，RASSF1A基因启动子高甲基化与肝癌风险显著相关(MSP: OR = 7.30, 95% CI = 5.17–10.29, P < 0.001; others: OR = 6.20, 95% CI = 3.13–12.30, P < 0.001)。样本大小亚组分析结果与汇聚分析的结果是一致的(≥ 100:OR = 6.74, 95% CI = 4.28–10.61, P<0.001; < 100:OR = 6.67, 95% CI = 4.46–10.00, P < 0.001) (图3)。
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and normal groups
HCC组与正常组RASSF1A启动子高甲基化水平比较
作者接下来首先利用来自26项研究的1898名肝癌样本和1002名正常样本的检测数据评估RASSF1A基因启动子甲基化如何患肝癌的风险(图4)。
meta分析提示与对照组相比，RASSF1A基因的启动子甲基化与肝癌风险显著相关(OR = 31.05, 95% CI = 13.73–70.20, P < 0.001)；但是，纳入文献存在较高的异质性(I 2 = 79.6%， P = 0.000)。进行亚组分析后的meta结果显示，RASSF1A启动子甲基化与HCC风险显著相关(图3)。
Relationship of the promoter hypermethylation of RASSF1A with the clinicopathological features
RASSF1A启动子高甲基化与临床病理特征的关系
作者通过提取纳入研究的肝癌患者基线数据分析RASSF1A基因启动子高甲基化与临床病理特征相关性。临床病理特征与RASSF1A基因的相关性展示在表2。Meta分析显示RASSF1A启动子的高甲基化与肿瘤大小，乙型肝炎病毒(HBV)感染显著相关。与性别，年龄，丙型肝炎病毒(HCV)，甲胎蛋白(AFP)水平，肿瘤数量,肝硬化,组织病理学,肿瘤分化或门静脉侵犯无显著相关性,
Meta regression and sensitivity analyses
Meta回归和敏感性分析
作者对两组中RASSF1A启动子高甲基化与肝癌风险的荟萃回归分析结果显示，样本类型、检测方法和样本量存在趋势。但是，meta结果中也检测到异质性。对此，作者利用亚组分析评估了不同特征对异质性的影响程度，然而大多数亚组的P值＞0.05，没有统计学意义。两组的异质性区间为9.70% ~ 8.14%，残差异质性水平较高。由于入组的研究缺乏足够的数据，作者没有将其他可能导致异质性的因素纳入meta回归分析。
接下来，作者通过敏感性分析进一步研究两组合并结果的稳健性，采用随机效应模型逐个剔除纳入的研究。没有一项研究对汇集的结果有显著的影响，表明作者的估计是稳健和可靠的。
Publication bias
发表性偏移
对于非肿瘤组，漏斗图似乎不对称，Begg’s检验(P = 0.021),提高发表性偏移。但是Eegg’s (P = 0.208)没有检测出发表性偏移。随后，采用修剪和填充法评估发表偏倚对meta结果的影响。最后，作者通过增加10个负向结果的研究再次生成了对称漏斗图。作者通过meta分析得到的这些结果仍然显著。同样，对于正常组，Egger s检验和漏斗图显示存在潜在的发表偏倚。随后，7个负性研究通过修饰和填充方法进行填充，合并分析发现RASSF1A启动子甲基化与肝癌风险显著相关。
Association of the promoter hypermethylation of RASSF1A with HCC related prognoses
RASSF1A启动子高甲基化与HCC相关预后的关系
Baseline patient characteristics
患者基线特征
作者接下来，评估了TCGA的肝癌样本及非肿瘤样本的RASSF1A-DNA甲基化数据，选取原位定位于RASSF1A启动子区域的11个探针(cg13872831、cg24859722、cg04743654、cg00777121、cg08047457、cg12966367、cg21554552、cg25747192、cg06172942、cg25486143、cg27569446)，均含有RASSF1A基因CpG岛A (chr3: 50340373–50341109)。
在TCGA队列中，肝癌样本中的RASSF1A启动子甲基化水平显著高于邻近的非癌性肝组织。根据探针甲基化水平，所有样品分为低甲基化组(n = 196)和高甲基化组(n = 184)。在380例TCGA来源的肝癌样本中，349例有总生存期(OS)和生存状态的信息，而342例有无病生存期(DFS)和复发状态的数据。
RASSF1A启动子高甲基化在预测HCC相关预后中的作用
作者进行Kaplan Meier生存分析发现，RASSF1A基因启动子高甲基化的患者的总生存期OS较差, 但是DFS高于低甲基化组。另外，受试者工作特征(ROC)曲线分析，RASSF1A基因启动子高甲基化预测肝癌患者1、2、3和5年OS的曲线下面积分别为0.51、0.60、0.60和0.58。同时，RASSF1A基因启动子高甲基化预测肝癌患者1、2、3和5年DFS的时间依赖性AUC值分别为0.61、0.69、0.63和0.73。据此，作者推断RASSF1A基因启动子甲基化状态具有较高的敏感性和特异性(图5)。
结论：
Meta分析纳入了涉及4777人的44项研究。肝癌患者RASSF1A启动子甲基化率明显高于非肿瘤患者和健康个体，且与乙肝病毒(HBV)感染阳性和肿瘤大小显著相关。Kaplan Meier生存分析显示，RASSF1A启动子高甲基化的HCC患者预后较差。受试者工作特性曲线证实，RASSF1A启动子甲基化可能是肝癌相关预后的标志。
看到这里，大家有没有发现2022年的生信文章已经不是简单的追热点了呢？过去因为有R语言的门槛在，TCGA和GEO中海量的测序数据让大家吃了一波红利，但是往后，R语言已经不是门槛，更多具备meta经验、基础研究背景的有心人已经加入生信发文的梯队。所以，要想在2022年获得一篇不错的paper，就需要找到有经验、有能力小伙伴来辅助大家进行生信研究呀。
