下呼吸道菌群失调影响肺癌进展

嗨咯~大家好呀，今天小编给大家带来一篇今年发表在Cancer Discov.（中科院JCR分区1区，IF: 39.397）的高分文章，本研究干湿结合，相得益彰，一起来欣赏学习大佬的研究成果吧！

研究背景及意义

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其发病率和死亡率高居不下。靶向治疗可以提高患者的生存率，然而其仅适用于约30%的肺腺癌患者。免疫治疗新疗法已被证明可影响患者体内T细胞对肿瘤抗原的反应，并提高肺癌患者的生存率，然而仍有40%~60%的患者对其无效或产生耐药性。已有研究在小鼠实验和对免疫治疗反应的癌症患者的分析中确定了与增强抗肿瘤免疫和对免疫治疗反应相关的肠道微生物。而这些研究大多集中在肠道微生物，呼吸道微生物和肺癌的相关性研究鲜少被提及。同时，研究表明正常个体的下呼吸道通常含有普雷沃氏菌和韦氏菌等口腔细菌，作者在先前的研究已证明了以口腔共生菌富集为特征的呼吸道菌群失调与个体的肺部炎性加重有关，这样的菌群失调可能触发宿主转录组信号改变（PI3K和 MAPK）。

为了进一步探究呼吸道微生物在肺癌中的临床意义，作者利用前瞻性人群队列和小鼠模型来确定可能影响肺癌预后的呼吸道微生物菌群。

结果解读

样本收集

作者团队在2013年3月至2018年10月间，从NYU Lung Cancer Biomarker Center招募了148名患有肺结节的受试者，这些患者都接受了临床支气管镜检查，作者从检查中获得了下呼吸道刷用来进行下一步研究，所有样本均在患者接受治疗前获得。其中15例患者为非肺原发肿瘤(转移)，12例患者为良性肺结节，38例患者为其他良性诊断而被排除未纳入研究队列，其余83名患者最终诊断为原发性肺癌，并被纳入这项研究。 在这些患者中，均有16S测序数据，70例患者有转录组数据，40例患者有RECIST（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）评估，75例患者有超过6个月的临床随访数据，64例患者有超过12个月的临床随访数据。样本临床信息见下表。

表1：研究队列临床信息表

肺癌进展相关微生物特征的挖掘

（1）不同部位样本的菌群差异

除了下呼吸道刷外，作者还从患者的支气管镜检查中获得了上呼吸道刷（口腔部）和支气管镜检查背景对照样本，这些样本被纳入16S 测序分析从而一并比较。基于Bray-Curtis 相异度指数的PCoA分析表明，不同部位样本的菌群β多样性显著不同（Figure 1a, PERMANOVA, p<0.001）。而在下呼吸道样本中，小细胞肺癌（SC）和非小细胞肺癌（NSCLC）的菌群β多样性也显著不同（PERMANOVA, p=0.01）。

（2）基于NSCLC临床TNM分期分类样本的菌群差异

在NSCLC样本中，作者根据临床TNM分期，同时基于以往的预后/生存数据和与NSCLC手术治疗相关的癌症管理指南，将样本分为I-IIIA和IIIB-IV这两组。PCoA分析表明，这两组样本的菌群β多样性存在显著差异（Figure 1b, PERMANOVA, p=0.005）。相比于I-IIIA组，IIIB-IV组的呼吸道样本菌群构成更接近口腔样本的菌群构成（Figure 1b, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。同时作者也比较了各个分期（I-IV）样本的菌群特征，结果表明，越晚期的病人样本，其呼吸道样本的菌群构成越接近于口腔样本的菌群构成。而MiRKAT分析表明，NSCLC I-IIIA组和IIIB-IV组之间的微生物群落分布差异并非由于样本位置的不同引起。

（3）不同PD-L1表达的病人样本的菌群差异

作者在肿瘤PD-L1表达值可获得的部分病人（n=39）中研究发现，相比于低表达PD-L1的病人（0%, n=16 和 1–79%, n= 11），高表达PD-L1的病人（(≥80%, n=12）其呼吸道样本的菌群构成更接近口腔样本的菌群构成(Supplementary Figure 5, Bray Curtis Distance, p<0.05)。

（4）不同生存率病人样本的菌群差异

PCoA分析确定了基于6个月和12个月生存率的病人样本，菌群成分具有显著差异(Figure 1c, PERMANOVA, p<0.05)，其中，与预后较好的病人相比，存活率较低的病人样本的菌群构成更接近口腔样本的菌群构成（Figure 1c, Bray Curtis Distance, p<0.0001）。而多元PERMANOVA分析表明，不同生存率病人其呼吸道菌群的差异与TNM分期无关。

（1）（2）（3）（4）结果初步表明，不同分组肺癌病人的呼吸道菌群存在显著差异，恶性程度越高的病人，其呼吸道菌群拥有越多的口腔共生菌。

（5）肺癌进展相关OTUs挖掘

作者在前面研究中，已初步探究到肺癌不同进展病人的呼吸道菌群构成存在差异，作者在接下来的研究中运用DESeq分析进一步寻找具体的差异OTUs（I-IIIA vs. IIIB-IV groups of NSCLC）。

基于矫正样本来源部位因素影响的混合效应模型，作者探究在NSCLC 中I-IIIA组和IIIB-IV组间丰度差异的top20 OTUs（根据绝对系数排序），结果表明，IIIB-IV组病人下呼吸道显著富集了在先前研究中被认为是口腔共生菌的OTUs，如嗜血杆菌属，梭杆菌属，孪生球菌属，普雷沃氏菌属和颗粒链菌属等（Supplementary Table 3）。而在I-IIIA组和IIIB-IV组内研究中，生存率较差的样本相比于生存率较好的样本，韦荣氏球菌属，普雷沃氏菌属和颗粒链菌属等显著增加（Supplementary Figure 9a–d, Supplementary File Table 2–5）。进一步的研究中，作者基于矫正样本来源病人的吸烟状态，TNM分期，以及治疗类型等因素影响的混合效应模型，确定了与肺癌总生存率相关的top20 OTUs，结果表明肺癌的不良预后与普雷沃氏菌属、链球菌属、乳酸杆菌属和孪生球菌属等口腔共生菌在下呼吸道的富集高度相关（Supplementary Table 4）。

而基于狄利克雷多项式模型（Dirichlet Multinomial Model, DMM），作者确定了样本可分为两类：第一类由所有上呼吸道样本和60%的下呼吸道样本组成，第二类由所有支气管镜背景对照样本和40%的下呼吸道样本组成。 与上呼吸道样本聚为一起的下呼吸道样本（60%）主要富集了韦荣氏球菌属、链球菌属、普雷沃氏菌属和嗜血杆菌属等，作者将这些菌群定义为SPT（supraglottic predominant taxa）。而与支气管镜背景对照样本聚为一起的下呼吸道样本（40%）则主要富集了黄杆菌属和假单胞菌属等，作者将这类菌群定义为BPT（background predominant taxa）（Supplementary Figure 12）。 与I-IIIA期NSCLC患者相比，IIIB-IV期NSCLC患者下呼吸道样本中被归类为富集SPT的样本占比更高(Figure 1d, p=0.006)。 而Kaplan-Meier生存分析显示，在I-IIIA期NSCLC患者中，SPT型比BPT型生存期更差(Figure 1e, p=0.047)，在IIIB-IV期NSCLC患者中，SPT型和BPT型的生存在统计学上没有差异。进一步的，作者在IIIB-IV期NSCLC患者中评估菌群与临床RECIST打分的相关性，在这部分病人中，上呼吸道和下呼吸道样本间的Bray-Curtis 相异度指数和RECIST打分呈显著负相关（Spearman r = −0.48, p=0.03）。因此，尽管这部分病人的总生存率与SPT型和BPT型分类无关，但该结果依然证明了RECIST评分为阳性（肿瘤进展）与下呼吸道的菌群构成更接近于上呼吸道的菌群构成有关，RECIST评分为阳性的病人下呼吸道中富集了更多的SPT（Supplementary Figure 14）。

作者在这部分结果中，进一步确认了与肺癌进展相关的OTUs，并将其定义为SPT（supraglottic predominant taxa）和BPT（background predominant taxa）。

Figure 1. Lung microbiota in lung cancer and cancer survival.

与SPT和BPT相关的转录组特征

作者从70例NSCLC患者的下呼吸道样本中获得了RNA-seq数据。不同于微生物特征，I-IIIA组和IIIB-IV组间的Bray-Curtis 相异度指数在统计学上并没有差异，DESeq分析仅在两组间找到20个差异表达基因，同样的，在不同生存率病人间，也仅有很少的差异表达基因被找到（Supplementary File Table 8）。

不同于寻常的分期分组，在基于SPT和BPT分型的样本分组中，更多的差异表达基因被挖掘（Figure 2a, FDR<0.25）。对这些差异基因进行功能富集发现，SPT与p53突变、PI3K/PTEN、ERK和IL-6/IL-8等典型通路的上调有关。

作者在这部分结果中，发现SPT和BPT可引起宿主转录组信号改变

多组学分析

为了更好的探究肺癌中宿主/微生物相互作用，作者运用了一个多组学分析框架（共现概率网络），以此来评估菌群与宿主的转录组特征共现的概率，同时用MMvec计算菌群出现在I-IIIA进展期和 IIIB-IV进展期的概率大小，并将其添加进网络中（Figure 2c），最后作者运用decontam软件包去除噪声，最终确认了韦荣氏球菌属（OTU#585419）为与肺癌进展最相关的OTUs，其还与细胞粘附分子、IL-17、细胞因子和生长因子、趋化因子信号通路、TNF、Jak-STAT、PI3K-Akt信号通路高度相关（Supplementary File Table 10）。基于BLAST，该OTUs最终被比对注释为Veillonella parvula。

作者在这部分结果中，最终确认了Veillonella parvula为呼吸道菌群中与肺癌进展最相关的菌

Figure 2. Airway transcriptome in NSCLC lung cancer based on lung microbiota.

呼吸道生态失调小鼠模型

作者在肺癌小鼠模型中验证由Veillonella parvula引起的下呼吸道生态失调对肺癌进展的影响（KP模型小鼠，Figure 3a）。结果表明，Veillonella parvula引起的下呼吸道生态失调对野生型小鼠的生存和体重不影响，而Veillonella parvula引起的下呼吸道生态失调导致KP模型肺癌小鼠生存期减少，体重降低，肿瘤负荷增加（Figure 3a, 3b, Supplementary Figure 18a,b）。

同时作者在生态失调诱导后第3周做了重复实验，通过转录组数据、基于FACS的T细胞谱数据和细胞因子测量数据来评估模型对生态失调的免疫反应：Ⅰ、转录组数据的PCoA分析结果显示，四种实验条件之间（WT, Dys, LC, LC+Dys）存在明显差异，其中LC+Dys组的转录组特征变化比LC组更大（Supplementary Figure 19a）。Ⅱ、基于CIBERSORT的肿瘤免疫微环境分析，明确了下呼吸道生态失调导致Th1细胞增加和树突状细胞激活（Supplementary Figure 19b）。Ⅲ、IPA分析结果显示，下呼吸道生态失调也导致了PI3k/Akt，ERK/MAPK，IL-17A，IL-6/IL-8和炎症小体信号通路的上调（Figure 3c）。

作者在比较小鼠模型中下呼吸气道生态失调诱导的转录组信号与SPT型NSCLC病人中识别的转录组信号时，发现IL-17信号、趋化因子、TOLL样受体、PD-L1信号和PI3K-Akt信号等相关的转录组特征信号变化是一致的。最终，作者得出结论，Veillonella parvula引起的下呼吸道生态失调导致Th17细胞增多，IL-17水平升高，PD-1⁺ T细胞表达增加，中性粒细胞增多（Figure 3e, Supplementary Figure 22a）。而CD4+、CD8+和中性粒细胞的免疫组化结果表明，这些炎性细胞的增加主要发生在没有肿瘤侵袭的肺组织中（Figure 3e）。

Figure 3. Pre-clinical model of lung dysbiosis in lung cancer and cancer survival.

为了进一步评估失调诱导的IL-17激活在肺癌进展中的重要性，在KP小鼠模型肿瘤发生后用抗IL-17单克隆抗体和同型对照抗体治疗小鼠两周（Figure 4a）。结果表明，和对照组相比，抗IL-17单抗治疗后的小鼠肿瘤负荷明显降低（p=0.0059, Figure 4b）。免疫微环境分析表明，抗IL-17单抗治疗后的小鼠，RORγt⁺ CD4⁺ T细胞和中性粒细胞表达明显降低，免疫组化结果表明，这些炎性细胞的减少发生在在没有肿瘤侵袭的肺组织中，而并非发生在肺癌组织中（Figure 4c, 4d）。

Figure 4. IL-17 blockade during lung dysbiosis in lung cancer preclinical model.

作者在这部分结果中，验证了Veillonella parvula引起的下呼吸道生态失调可促进肺癌肿瘤炎症微环境，表现为Th17 细胞增多，激活具有潜在抗原呈递能力的树突细胞，以及癌旁组织中检查点抑制剂标记物的增加。

小编总结

在这项研究中，作者首次提出并证实了肺癌患者下呼吸道菌群的失调将会改变宿主的转录组信号通路以及促进肿瘤炎症微环境，从而影响肺癌发生发展和病人预后。在通篇研读完这篇文章后，小编不禁感慨这篇高分文章工作量之大，细节处理之妙，上下文结构遥相呼应，干湿结合，逻辑通畅，建议大家下载原文来研读学习！