2014年9月，中科院遗传所高彩霞团队在《Nature Protocols》杂志上发表了题为“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章，详细描述了利用CRISPR/Cas系统实现水稻和小麦基因组编辑的实验方案。

如今2018年2月1日高彩霞团队在《Nature Protocols》杂志又发表了题为“Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins”的文章，作为小麦基因组编辑的升级版本，可以说将小麦基因组编辑技术进一步向前推进。

文献摘要

近年来，CRISPR / Cas9已经成为改善作物性状的有力工具。常规的植物基因组编辑主要依靠通过农杆菌或粒子轰击让质粒携带进行传递后实现编辑。通过粒子轰击传递CRISPR / Cas9的体外转录物（IVT）或核糖核蛋白复合物（RNPs）实现面包小麦的DNA-free的编辑系统。该方法是之前发表的通过粒子轰击传递CRISPR / Cas9质粒的小麦基因组编辑方法的延伸。新的描述的方法不仅消除CRISPR / Cas9随机整合到基因组DNA中，而且减少了脱靶效应。在这个新的方法中，提供了IVT和RNP的准备的详细实验操作步骤，并通过PCR /限制性内切酶（RE）和下一代测序验证;通过使用新的方法，可以在9-11周内获得和鉴定不使用任何外来DNA编辑的植物。

CRISPR/Cas9 IVT-或RNP介导的小麦基因组编辑的概述

整个实验流程包括了CRISPR / Cas9 IVT和RNP的制备，包衣，传递，幼苗再生和突变体筛选。首先在原生质体瞬时转化系统中测定和评估高活性的候选的sgRNA，然后使用sgRNA序列上游T7启动子（步骤1-13）对PCR产物进行转录。使用经过密码子优化的、侧翼有两个NLS序列、玉米泛素1基因的5'-和3'-非翻译区序列及PolyA信号序列的XbaI-linearized pLZT7-zCas9转录Cas9 mRNA（步骤14A）。细菌细胞诱导，表达和纯化Cas9蛋白质（步骤14B）。预组装的RNP复合物通过体外切割（步骤15-19）和原生质体瞬时表达分析（步骤20-30）进行验证。获得未成熟的胚芽的植物在温室中需要生长90天，应该提前启动培养（步骤31）。然后将CRISPR / Cas9 IVT或RNP传递到收获的未成熟胚芽中（步骤32-37），并通过NGS确认传递（步骤38-46;图2）。在整个组织培养过程中不使用抗生素。2周后诱导产生胚性愈伤组织（步骤47），4-6周后完成再生（步骤48-50）。首先通过PCR / RE利用保守的引物同时识别库中三种不同类型的突变体幼苗（步骤51-57）。蓝色的表示代表性的突变体。给出阳性信号的幼苗通过PCR / RE和用homolog-specific primer 扩增后测序（步骤58-61）。 NHEJ引入的突变可导致未分离的条带，以蓝色表示。He：杂合突变体;Ho:纯合突变体; WT/D，用限制性内切酶消化的野生型扩增产物; WT/U，野生型扩增产物没有被消化。

参考文献

Shan, Q., Wang, Y., Li, J., & Gao, C. (2014). Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nature protocols, 9(10), 2395.

Zhen Liang  et al. (2018). Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins. Nature protocols

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