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今天给大家分享一篇重庆医科大学附属第一医院的研究团队于今年7月份发表在Molecular oncology (IF=6.574)上的文章，作者通过整合多组学数据刻画了高级别雌激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌。
在这项研究中，作者系统地分析了临床数据和多组学数据，探索了针对高级别 ER+ HER2-乳腺癌患者的个性化治疗潜在策略。该研究数据表明，与较低级别的肿瘤相比，III 级 ER+ HER2- 肿瘤具有不同的临床和分子特征，尤其是在具有non-luminal样的病例中。
研究背景：
（1）雌激素受体阳性和人表皮生长因子受体 2 阴性 (ER+ HER2-) 的乳腺癌约占所有浸润性乳腺癌病例的 60-70%。
（2）高组织学分级的ER+ HER2- 肿瘤对内分泌治疗应答不佳，但为什么出现该现象的原因尚不清楚。
研究数据：
（1）六个患者队列如下，包含了临床病理数据、多组学数据和随访数据：
（2）来自美国国家癌症研究所（NCI）2019年4月发布的监测、流行病学和最终结果数据库(SEER)。该数据库中的150060例HER2阴性患者中，25 629例(17.1%)为ER+ HER2-。
（3）来自乳腺癌国际联盟(METABRIC)，包含404例III级ER+ HER2-病例，有RNAseq、体细胞突变、拷贝数改变(CNAs)和临床数据。
（4）来自癌症基因组图谱(TCGA)，包含88例III级ER+ HER2-病例，有RNAseq、体细胞突变、拷贝数改变(CNAs)和临床数据。
（5）来自纪念斯隆凯特琳癌症中心(MSKCC)，包含272例无转移和39例转移III级ER+ HER-患者的体细胞突变和CNAs数据。
（6）来自华西临床合作组(WCCCG)，包含546例ER+ HER2- III级患者。
（7）来自复旦大学上海肿瘤中心(FUSCC)，包含348例ER+ HER2- III级患者。
研究结果：
一、ER+ HER2-III级肿瘤的临床病理特征及生存结局：
（1）与 I/II 级 ER+ HER2- 肿瘤病例相比，III 级 ER+ HER2- 患者的诊断年龄更小、内在 B 样亚型更多、浸润性导管癌、肿瘤更大、淋巴癌风险更大淋巴结转移，接受化疗的机会更高。
（2）在对混杂因素进行全面校正后，发现与 I/II 级 ER+ HER2- 病例或 TNBC 相比，III 级 ER+ HER2- 病例的中位生存结局更差，包括 DFS、OS和BCSS三个指标。
（3）为了系统地评估分子亚型和组织学分级对 BCSS 的影响，作者对 SEER 队列中于 2010 年至 2014 年间诊断出的所有非转移性女性乳腺癌患者进行了生存分析。发现较高的组织学分级与 ER+ HER2- 病例的死亡风险增加密切相关（如图1E），但在其他表型中发现中等关联（ER+ HER2+ 和 TNBC）以及没有关联（ER-PR-HER2+）。
（4）在接受内分泌治疗的 ER+ HER2-亚组中，与 I/II 级病例相比，III 级病例与更差的 DFS 相关（如图 1C，D、H、K），但 III 级和 I/未接受内分泌治疗的 II 例（如图 1G、H）。
二、多组学数据概况：
（1）与 I/II 级 ER+ HER2- 病例相比，III 级 ER+ HER2- 患者呈现出更高的致癌通路增殖评分、细胞周期、DNA 损伤反应评分和更低的激素评分（如图2A）
（2）通过比较三组之间的体细胞改变，包括基因水平突变和 CNAs（如图2B,C），发现与I/II 级病例相比，已知的癌症驱动事件，如突变的 TP53（42.0% vs. 8.8%）和 RB1 缺失（60.9% vs. 35.8%）在 III 级病例中更为丰富。
三、ER+ HER2-组织学分级III的患者的全基因组范围的DNA甲基化分析：
（1）作者通过整合Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip平台(HM450)的DNA甲基化分析结果和TCGA的RNA-seq数据，识别出了显著的高/低甲基化基因（DMC）。
（2）与正常组织(n = 14)相比，在III级ER+ HER2-病例中，高甲基化的DMC为11 085个，低甲基化的DMC为14829个，基因mRNA表达下调678个，上调3726个(如图3.1A)。
（3）唯一overlap的DMC基因对cg18629132-MKI67 (如图3.1B,C)。这一结果表明，III级ER+ HER2-病例可能在分化过程中失去DNA甲基化，通过表观遗传学上调MKI67表达，从而促进肿瘤的增殖。
（4）为了验证这一结果，作者对来自重庆医科大学第一附属医院的样本进行了MSP分析。MKI67启动子的甲基化在所有I/II级ER+ HER2-肿瘤(10/10)和正常乳腺组织样本(15/15)中均检测到，但在10个III级ER+ HER2-肿瘤中仅检测到3个(30%)，在15个TNBC组织中检测到0个(如图3.1E)。
（5）进一步，在TCGA和WCCCG队列中又验证了该现象，III级ER+ HER2-肿瘤与MKI67的mRNA和蛋白表达水平分别高于I/II级肿瘤(如图3.2F,G)。另外，与I/II级肿瘤相比，III级ER+ HER2-患者的MKI67基因组区域overlap的拷贝数扩增事件更多，这可能有助于MKI67 mRNA的高表达(如图3.2H,I)。
四、ER+ HER2-的组织学分级III的肿瘤的CAN分析：
作者分别计算了广义(BCS)、聚焦(FCS)和全球(GCS) CNA评分，为每个样本提供了三种不同的CNA水平量化值。发现与低级别ER+ HER2-肿瘤相比，III组织学级别的ER+ HER2-肿瘤具有更高的FCS(中位数296 vs 94)、BCS(中位数40.5 vs 10)和GCS(中位数0.95 vs 0.72)（如图4.1 A,B）。
五、ER+ HER2-III级肿瘤中候选驱动事件的识别：
（1）作者根据 MSKCC 队列的初治原发性（n = 270）和治疗后转移性疾病（n = 243）确定 III 级 ER+ HER2- 肿瘤患者的候选驱动事件。与未接受治疗的肿瘤相比，在芳香酶抑制剂治疗的转移样本中检测到基因 ESR1（10.3% 对 1.1%）和 TP53（48.6% 对 31.1%）的突变富集（如图4.1D）。转移性疾病患者的大部分 TP53 改变是位于 DNA 结合域的错义突变，而一些也存在于四聚化域中（如图4.2E）。
（2）作者使用GISTIC 确定了来自 TCGA 的 III 级 ER+ HER2 -病例中的 16 个致癌性focal事件（如图4.2F），以及来自 MSKCC 的转移性 III 级 ER+ HER2-病例中的 10个focal事件（如图4.2G）。
（3）在 METABRIC 队列中，根据诊断年龄、肿瘤分期、放疗、内分泌治疗、化疗和手术调整的多变量 Cox 比例风险回归表明 MDM2 扩增是 OS（如图4.2H）和 BCSS（如图4.2F）的独立预后因素。同样，有 MYC 扩增的 III 级 ER+ HER2- 患者与没有 MYC 扩增的患者相比，OS 有缩短的趋势（如图 4.2I）。
（4）当通过 GSEA 在 III 级 ER+ HER2 乳腺癌中评估 MDM2/MYC 扩增组中的富集通路时，发现具有 MDM2/MYC 扩增的 III 级 ER+ HER2-患者富含细胞周期 KEGG 通路（如图 4J,K）。
六、ER+ HER2-的III级乳腺癌患者的治疗应答根据其内在亚型而不同：
（1）作者比较了 I/II 级和 III 级 ER+ HER2- 肿瘤之间的内在亚型分布。与 I/II 级肿瘤患者相比，III 级 ER+ HER2-乳腺癌患者中有更多的luminal B样亚型和non-luminal样亚型（即正常样、HER2 富集和basal样）（如图5.1A），表明高级别肿瘤是异质的。
（2）为了鉴定luminal亚型和non-luminal亚型之间的分子差异，作者对两组肿瘤进行了差异基因表达分析，共鉴定了 641 个差异表达基因（如图5.1B），其中 255 个在非管腔亚型中上调，386 个在管腔亚型中上调。
（3）计算了 6475 条已知通路的 GSVA 评分，并对来自 III级ER+ HER2- 患者的non-luminal样和luminal样肿瘤进行了类似的差异比较。发现 147 条统计学差异通路在non-luminal样肿瘤中上调，25 条在luminal样肿瘤中上调（如图5.1C）。
（4）T 细胞标志物、上皮间质转化、通过 NF-kB 通路的 TNF 信号、细胞因子信号基因以及免疫相关通路，如 PD-1、CD8、IL-2 和 IL-12 信号通路，以及免疫细胞类型特征，如细胞毒性细胞和 NK 细胞在non-luminal组中上调（如图5.1C、5.2D）。
（5）为了阐明临床实践中non-luminal样的预测面板，作者开发了一个双基因面板（GATA3 和 AGR3）来识别 III 级 ER+ HER2 患者中的non-luminal样病例，其中 GATA3 和 AGR3 都倾向于与管腔样亚型相关（如图5.2E）。TCGA 数据库和 METABRIC 数据库中双基因分类器的混淆矩阵表明，对训练集（TCGA）和验证集（METABRIC）的准确率分别为 98.8% 和 84.2%（如图5.2F）。
（6）作者通过IHC实验进一步验证了这个双基因面板（如图5G,H,J）。
文章小结：
该研究表明与低/中级肿瘤相比，高组织学级别ER+ HER2-肿瘤患者更有可能出现不良预后，特别是在临床实践中，可以使用作者开发的双基因分类器来识别non-lunimal病例。该研究结果也表明了针对组织III级ER+ HER2-乳腺癌定制个性化治疗的重要性，并且对于作者所提到的潜在靶向药物也值得后续的临床验证。
