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小编今天跟大家分享的是8月10号发表在EBioMedicine 6+上的一篇文章
口腔鳞状细胞癌诊断和预后marker：AUNIP基因
Abstract
Result
一、识别OSCC上调差异基因
GSE3524、GSE30784、GSE78060三个数据集筛选OSCC差异基因，上调基因的火山图（见图1a-c）;得到共同上调的90个差异基因（见图1d); 90个上调基因在TCGA数据库有正常对照的样本中的聚类热图（见图1e）
图1
二、识别OSCC关键的诊断marker
基于TCGA数据采用ROC曲线分析及AUC值评估90个上调基因的敏感性和特异性。前十的基因AUC值均>0.94,证明对OSCC有很高对诊断意义（见图2a）；为了验证这10个基因的诊断显著性，在GSE30784数据集中进行ROC曲线分析（结果见图2b）；从先前对OSCC甚至其他癌症的研究看，我们在列表中发现了一个鲜为人报道的基因：AUNIP。GSE30784、TCGA中AUNIP ROC曲线下面积为0.94、0.987（见图2c-d）；TCGA中，在0.781的约登指数（正确指数）时，有78.1%的预测准确性和100%的特异性。GSE30784中，在0.899的约登指数时，有92.22%的预测准确性和97.78%的特异性。鉴于此，本研究通过探索AUNIP 研究OSCC。为了进一步验证AUNIP 诊断准确性，基于TCGA数据构建Logistic回归模型进行5倍交叉验证，ROC曲线（见图2e）；混淆矩阵（见图2f）；倍性所有指标均值（见图2g）。以上结果表明AUNIP可以很好区分OSCC和正常。
图2
三、AUNIP过表达与OSCC进程和肿瘤纯度相关
1、AUNIP 在TCGA数据OSCC患者中显著高表达（见图3a）;AUNIP 同样在HPV阳性分组、ESTIMATE计算的基质评分低分组和免疫评分低分组中过表达（见图3b-d）；AUNIP表达在OSCC发展进程中逐渐增加（histologic grades and tumor T stages）（见图3e-f）；以上表明AUNIP过表达与OSCC中HPV感染(positive;P<0.001)、基质评分(low;P<0.001)、免疫评分(low;P<0.016)、淋巴管浸润(yes;P=0.049)、组织学等级(poor;P=0.036)、肿瘤等级(T3+T4;P=0.006)有关(见Table1)。AUNIP与ESTIMATE评分呈负相关（r=-0.348;P<0.001）,表明AUNIP与肿瘤纯度正相关（见图3g）。
图3
2、实验验证AUNIP表达：蛋白质印迹和免疫组化染色表明AUNIP在OSCC病人中过表达（见图4a-c）;配对癌旁组织和肿瘤组织表达情况（见图4d）；并且AUNIP蛋白表达随着肿瘤的恶性程度增加而增加（见图4c、e）;免疫组化染色ROC曲线分析AUC值为0.725，具有统计学意义，可支持AUNIP对OSCC的诊断（见图4f）。
图4
四、权重基因共表达网络构建及识别核心模块
1、基于GSE41613 OSCC表达谱数据（剔除离群样本后96样本）构建WGCNA网络，见图（a）；设定软阈值为8时网路为无尺度网络（见图5b-c）；动态剪切树法得到网络中13个共表达模块（见图5d）；选取1000个基因绘制拓扑重叠热图（见图5e）;模块和临床特征相关性分析表明，黄色模块是与OSCC预后最相关的模块（见图5f），该模块刚好包含了OSCC诊断marker：AUNIP基因。
图5
五、与AUNIP正相关的基因富集到细胞周期和HPV感染过程
1、基于WGCNA网络拓扑重叠构建了AUNIP正相关的134个基因的网络，这些基因都有相似的表达（见图6b-c）;对这些基因进行GO和KEGG通路富集分析，GO分析显示富集到了“DNA replication, chromosome segregation, nuclear division, G1/S transition of mitotic cell cycle, cell cycle checkpoint, regulation of mitotic cell cycle phase transition”，KEGG通路则富集到了“cell cycle pathway, DNA replication, mismatch repair”（见图6d-e）。
图6
2、与AUNIP表达相关的Hallmarks, GO, KEGG pathway基因集使用GSEA富集分析（见图7a-f），富集到了“Cell cycle checkpoint, cell cycle phase transition”等；鉴于AUNIP在OSCC的细胞周期调控，DNA修复和HPV感染中起至关重要的作用，本研究基于TCGA数据进行了相关分析，以评估AUNIP与几个OSCC致病基因之间的关系（见图7g）,结果显示CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶1）等9个基因与AUNIP高度正相关，且它们都在上图6b）网络中。可以推测AUNIP可以调节有丝分裂细胞周期进程，与OSCC中HPV感染有关，在肿瘤发生过程中起重要作用。
图7
六、体外试验证明：AUNIP促进OSCC细胞增殖和控制细胞周期进程
为了证明AUNIP以上生物学过程，在SCC-9 and SCC-15 OSCC细胞系中抑制其表达（见图8a-b）,结果表明AUNIP耗尽后细胞集落显著减少（见图8c）,应用流式细胞术分析细胞周期， 观察到有AUNIP抑制作用的OSCC细胞停滞在G0 / G1期（见图8d），证实了AUNIP在控制细胞周期过程中的作用。
图8
七、OSCC患者中AUNIP高表达显示差的预后效果
基于GSE41613 and TCGA AUNIP表达数据进行K-M生存分析和Log-Rank
检验，结果发现在两个数据集中AUNIP过表达显示出很低生存率（见图8e-f）；cox单因素回归分析发现AUNIP表达、放射治疗等7个具有统计学意义的预后因子，cox多因素回归分析则表明AUNIP表达是独立的OSCC预后因子（HR=1.421，CI=1.012-2.459，p=0.043）（见Table2）
总结：本文先通过几个数据集结合文献筛选出想要研究的OSCC基因，通过公开数据库和实验来分析和验证基因对OSCC诊断效能。实验验证了基因在OSCC中作用机制，也研究了与OSCC免疫、预后的关系。总的来说实验较多
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