炎症免疫ceRNA网络的构建

今天给大家介绍的文章发表在期刊Journal of Clinical Periodontology上，这个期刊在最近一年的影响因子为8.728，比上一年增长了3.487。中科院大类: 医学 2区，中科院小类: 1区 牙科与口腔外科。该期刊虽然只收录口腔科的文章，但这篇文章有很多值得我们学习的地方。文章思维简单，可重复性强，非常值得我们借鉴。

思维导图：

发现问题：

最近的研究主要集中在检测MIAT在牙周组织中的表达水平。然而，它是否影响牙周炎的进展仍不清楚。

背景知识：

牙周炎是一种非传染性疾病，全球发病率和流行率很高。随着疾病的进展，牙齿支持组织发生炎症和再吸收，最终导致牙齿脱落和全身炎症。宿主的免疫反应是破坏的主要原因。由于这些特点，免疫治疗被认为是一种很有前途的牙周炎新疗法。

从GEO数据库中获取牙龈组织的基因表达谱。进行生物信息学分析，建立免疫相关的ceRNA网络。随后，进行功能富集分析，以检测ceRNA网络可能参与的生物学过程。

DEL：differentially expressed lncRNAs，差异表达的lncRNA。

结果解读：

差异表达的lncRNA的鉴定及分类模型的构建

在队列中，检测到12个DEL。其中，4个在牙周炎样本中上调，8个在牙周炎样本中下调（Figure 1A）。为了进一步缩小范围，建立分类模型，作者进行了LASSO Logistic回归分析。随着调谐参数λ的变化，相应的DELS系数减小到零。最后，七个lncRNA (CDC42-IT1, LINC00592, MIAT, MIR210HG, MBNL1-AS1, SOX21-AS1, and LINC01133) formed the classification model (Figure 1B)。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，7个lncRNA的组合比单个lncRNA表现出更可靠的分类(Figure 1C)。分类模型的曲线下面积（AUC）为0.976。对于单个lncRNA，最高AUC值为0.907（MIAT）。通过计算队列中的Youden指数(Youden指数=真阳性率+真阴性率-1)，确定了每个品种的最佳截止水平。与ROC分析结果相似，分类模型的尤登指数最高，达到0.880 (Figure 1D)。根据最佳分界值，将内验证队列中的样本分为牙周炎组和健康组，7个lncRNAs的组合比单独使用lncRNAs的分类效果更好(Figure 1E)。进一步的ROC分析表明，内部和外部验证队列(GSE106090)的AUC值分别达到0.878和0.833，表明该分类模型具有较好的判别能力(Figure 1F)。这些结果表明，该模型可以有效地区分牙周炎样本和健康对照。

Figure 1. Construction and validation of the classification model.

(A)火山图显示了牙周炎组织中差异表达的LncRNA，包括4个上调的LncRNAs和8个下调的LncRNAs。

(B)执行交叉验证以筛选最佳调谐参数(λ)。

(C，D)ROC分析和Youden指数分析表明，该分类模型有足够的能力区分牙周炎样本和健康对照。

(E)分类模型的Youden指数也在内部验证队列中排名第一。

(F)内部和外部验证队列的ROC分析表明，分类模型具有令人满意的判定能力。

7个选定的lncRNA与免疫signatures的相关性

由于lncRNAs在免疫系统中起着至关重要的作用，作者探讨了lncRNAs与免疫细胞的关系。使用R包“gsva”计算单个样本的免疫signatures富集分数。如小提琴曲线图所示，牙周炎样本中除CD56^bright自然杀伤细胞、CD56^dim自然杀伤细胞和Th2细胞外，大多数免疫信号显著增强（Figure 2)。相反，效应记忆CD4 T细胞在牙周炎样本中表达下调。接下来，作者进行了Spearman的相关性分析，以探索所选择的七个lncRNA与免疫特征之间的关系。热图显示，lncRNA MIAT与三种先天免疫信号（浆细胞样树突状细胞、髓系来源的抑制细胞和自然杀伤细胞）和6个获得性免疫亚群（活化的B细胞、未成熟的B细胞、中央记忆CD4T细胞、效应记忆CD8T细胞、调节性T细胞和Th1细胞）呈正相关。活化的B细胞与lncRNA MIAT的相关性最强。除Cdc42-IT1外，其余lncRNAs与7个天然免疫细胞和7个获得性免疫细胞呈负相关，相关系数<-0.6(lower part of Figure 2)。这些结果表明，分类模型中的7个LncRNA与免疫有很强的相关性。

Figure 2. Enrichment levels of immune subpopulations and their relationship with seven selected lncRNAs。上半部分显示免疫细胞的分布。多数在牙周炎标本中增加。下半部分显示了免疫细胞与7个选定的lncRNA之间的关系。

筛选的7个lncRNAs对基因表达的潜在调控作用

基于这7个lncRNA组成的分类模型具有显著的分类能力和与免疫的密切关系，作者进一步进行了WGCNA分析，以评估这7个lncRNA对基因表达的潜在调控作用。选择调整p值小于0.05的差异表达mRNA。最后，作者鉴定了7个mRNA模块，其中每个模块至少与一个lncRNA有显著的相关性，这表明这些与特定的mRNA模块相关的lncRNA对基因表达有相似的调控作用(Figure 3A)。在这些模块中，蓝色模块与lncRNA MIAT呈最强的正相关(correlation coefficient = 0.82)。选择蓝色模块中的mRNA进行进一步的功能富集分析。结果表明，它们参与了许多与免疫相关的生物学过程，包括中性粒细胞的激活和脱颗粒；中性粒细胞介导的免疫；白细胞、单核细胞、淋巴细胞和B细胞的增殖；B细胞的激活；白细胞和B细胞增殖的调节(Figure 3B)。结合lncRNA MIAT与活化的B细胞呈正相关的观察，作者重点研究了与B细胞活化和增殖相关的mRNAs。55个相关的mRNA参与了B细胞的激活过程，其中25个参与了B细胞的增殖调控，30个参与了B细胞的增殖(Figure 3C)。KEGG通路分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、蛋白质输出、内质网中的蛋白质加工、B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、NF-κB信号通路和破骨细胞分化与蓝色模块的mRNA显著相关(Figure 3D)。因此，lncRNA MIAT与这些富集基因形成的蓝色模块具有最强的正相关性，可能参与多种免疫应答过程。

Figure 3. WGCNA and functional enrichment analysis.

(A)mRNA模块与选定的lncRNAs之间的相关热图显示，lncRNA MIAT与蓝色模块的正相关性最强。

(B)蓝色模块的生物过程富集分析。

(C)参与B细胞相关生物学过程的mRNA。

(D)蓝色模块的KEGG途径富集分析。

ceRNA网络的构建与分析

基于lncRNA MIAT与蓝色模块的高度相关性，作者进一步构建了基于MIAT、差异表达miRNAs(GSE54710)和蓝色模块mRNAs的ceRNA网络。在ceRNA网络中，作者确定了5个miRNA节点和100个mRNA节点(Figure 4A)。牙周炎组miR-1246、miR-1260b和miR-4286表达下调，miR-3652和miR-1202表达上调(Figure 4B)。此外，还进行了相关分析以筛选与lncRNA MIAT强相关的mRNAs。在27个强相关的mRNAs中，POU2F2、IFNAR2、LAX1和XBP1与LncRNA MIAT有较强的相关性，相关系数均在0.80以上。此外，27个筛选的mRNA构建了一个亚ceRNA网络(Figure 4C)。功能富集分析表明，它们与B细胞的各种生物学过程有关，包括B细胞的激活、增殖和分化以及免疫球蛋白的分泌和产生(Figure 4D and E)。

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Figure 4. Establishment of a ceRNA network.

(A)lncRNA-miRNA-mRNA网络。菱形表示lncRNA，三角形表示miRNA，圆形表示mRNA。

(B)LncRNA MIAT、5个miRNAs和27个强相关mRNAs的表达水平。

(C)以lncRNA MIAT、4个miRNAs和27个筛选的mRNAs为基础的ceRNA亚网络。

(D) ceRNA网络中mRNAs的生物过程富集分析。

(E)丰富的mRNA及其参与的生物过程。

全文小结：

综上所述，作者发现了一个ceRNA网络，它可能参与调控牙周炎进展过程中B细胞的增殖、分化和激活。在这个网络中，lncRNA MIAT可能竞争性地与miR-1246、miR-1260b、miR-3652和miR-4286结合，促进mRNAs的表达，从而影响B细胞的生物学过程。综上所述，本研究为进一步探讨lncRNA MIAT在牙周炎发生发展中的分子机制提供了新的参考，也为潜在的免疫治疗靶点提供了新的参考。