今天，小编跟大家分享的是一篇发表在frontiers in Oncology杂志上的文章。人类粘膜黑色素瘤(hMM)是一种起源于神经外胚层的侵袭性肿瘤，其在分子水平上的典型特征是大的染色体畸变，而非单核苷酸突变。但由于案例的缺乏，需要建立动物模型来对其进行研究，而犬口腔黑色素瘤(COM)与hMM在临床和组织学方面具有相似之处，因此本文通过对COM样本数据进行竞争性杂交等一系列分析，强调了以狗作为模型研究hMMs的可行性以及抗血管生成因子在治疗晚期和转移性COMs中的重要作用。

Array Comparative Genomic Hybridization Analysis Reveals Significantly Enriched Pathways in Canine Oral Melanoma

通过阵列比较基因组杂交分析来揭示犬口腔黑色素瘤中显著富集的通路

数据和方法

数据处理

福尔马林固定、石蜡包埋(FFEP)的COM样本收集自Padua和Madrid大学，由一位兽医专家确认COM的初步诊断，并评估是否有足够数量的健康组织用于核酸提取，最终有40个样本用于后续分析；接下来是对样本核酸的提取和纯化，筛选后留取24个样本，对其基因组DNA进行花菁标记(疾病和正常样本分别为Cy3、Cy5)；然后，匹配的Cy3/Cy5活性达到足够程度的20个样本被用来做共杂交分析。

CNAs分析

过滤掉不均匀杂交或信号饱和的探针后，对数据并使用集中算法进行归一化处理，每个点的Cy5/Cy3强度比值转化为log2ratios；ADM-2算法被用来定义CNAs，然后用Agilent Genomic Workbench v. 7.0筛选常染色体的畸变间隔，拷贝数gain和loss分别被定义为log2ratio>0.25和log2ratio<-0.25，拷贝数amplification和deletion则分别定义为log2ratio≥1和log2ratio≤–1；GISTIC2.0模块识别了不同样本间显著扩增或缺失的基因组区域，对每一个畸变区域计算其FDR值，显著性阈值为0.05。为了比较犬CNV谱与最近人类文献中描述的畸变，Liftover Batch Coordinate Conversion Tool用来识别同源区域，几种已发表的其他方法也用来进行数据的比较分析。

通路富集分析

作者用Ensemble Genome Browser识别了同源人类基因，对以下4个基因列表做通路分析：扩增外显率≥25%(GR25)、扩增外显率≥40%(GR40)、缺失外显率≥25%(LR25)和GISTIC分析识别出的显著区域(GS)；然后用Cytoscape中的ClueGo插件将其作为人类同源基因进行分析，基于KEGG, GO, REACTOME等将基因分配到网络中，最后将通路可视化为基于kappa得分的功能组，每个组根据最显著的功能类命名。此外，作者还对20个样本做了免疫组织化学评估。

结果

样本采集和免疫组织化学分析

总共20份样本(包括肿瘤和匹配的正常组织)被挑选出做花菁标记，并进行了aCGH分析，删除一例杂交质量差的样本后，最终保留了19个。对每一个样本，利用Ki 67抗体做了免疫组化分析(IHC)，阈值Ki67值>19.5被用于预测黑色素瘤在诊断后1年内的死亡，样本被分为GOOD (G,5个样本) 和BAD (B,15个样本，包括被删除的样本)组。

畸变的基因组模式

COM样本的CNAs图谱如图1所示，除了A5和A35样本没有检测到畸变外，剩余样本的平均突变数目为27.6，整个基因组突变模式包括53个扩增区域和20个缺失区域。扩增区域常出现于CFA 10、13和30号染色体，而缺失区域对CFA 10、11、22和30号染色体影响较大，其中，CFA 13在37%(7/19)的样本中表现出全染色体的扩增，而CFA 22在25%(5/19)的样本中表现出全染色体的缺失。发生频率最高的畸变是G组中区域chr11：41248370-41248429的缺失，在五个样本中有三个样本检测到。GISTIC2.0算法识别出20个位于CFA 9, 10, 13和30上的扩增区域，但未识别出显著的缺失区域。

图1. COM的CNAs

通路富集分析

矫正后的Benjamini-Hochberg P<0.05的通路被认为是显著富集的，结果GR25基因集显著富集了60条通路，LR25组显著富集了10条，GS组有49条，GR40组未发现显著富集的通路(图2)。

图2. 通路富集分析结果

表1列出了部分通路以及相应的基因，许多通路与药物代谢相关，其他通路也多与黑色素细胞相关。此外，作者发现GR25和GS组的富集通路交叠最多，GR25组的通路包括血管再生、糖脂化等，GS组通路有T-helper I型免疫应答等，LR25组则包括血管生成相关细胞迁移的负调控和LPC水解等。

表1. 部分显著富集的通路

犬和人类CNAs的比较分析

对犬和人类基因组中的同源染色体区域进行检测，以评估COMs和hMMs之间保守的CNAs。比较分析揭示了COMs和hMMs间共享的32个区域，其中CFA 9、10和13上的扩增分别与HSA 17、12和8-4是同源的，CFA 11、22和30的缺失与HSA 9、13和15是同源的。GR25、LR25和GS这三组的CNAs以及与其他研究的对比如表2所示，在所有研究中，出现次数最多的是CFA 13:1722286–32543593, 对应HSA 8:99748261–136957380。

表2. 三组的CNAs

对于其他研究发现的候选肿瘤基因，MYC、KIT和PDGFRA的扩增在COMs和hMMs具有一致性，BUB1B、KNSTRN、CYSLTR2和SPRED1的缺失也是一致的。值得关注的是，B2M在COMs和hMMs中均被发现不平衡，但在该研究中发生的是扩增而非缺失。常被其他研究提到的基因BRAF、MDM2、CDK4、CCND1、CDKN2A、PTEN和TP53在该文中并未检测到异常。

表3. 本研究和其他研究中发现的目标基因的比较 

与已发表犬CNAs的比较

目前，COM最常被报道的异常是CFA 13、17的增益和CFA 11、15、22的缺失以及CFA 10、30的反曲趋势，本研究的发现与之一致。CNAs中的几个基因在COMs和hMMs的发展过程中起着重要的作用，包括TRPM7、MYC、KIT、WIF1、SLC27A2、GABPB1、USP8、CYP19A1和SPPL2A的扩增以及RB1、LCP1、BUB1B、KNSTRN、CYSLTR2、SPRED1和FAM98B的缺失(表3)。此外，有研究表明ADAM10和SNORA、SNORD、SLC25A、RPL、RBM家族的基因在转移性COMs中是高表达的。

好了，今天的文献为大家解读到这，祝各位小伙伴每天都有进步吆！

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