植物功能基因组学研究技术的发展

随着植物基因组学的发展，植物研究的热点转向了功能基因组学。如何确定大量的基因序列的功能，并进而了解基因与基因之间通过其代谢产物而形成的控制生物体代谢和发育的调控网络是功能基因组学研究的核心问题。在植物功能基因组学研究中，多摒弃原来传统的技术而采用新发展的方法，既省力又节源的研究基因的功能。

关键词：功能基因组学；表达序列标签技术；代谢组学；RNA干扰

二十一世纪以来，基因组学在各种模式生物基因组测序的完成的基础上发展迅速。基因组学已经产生很多个分支，比如结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学等。其中，结构基因组学是基因组学发展的初级阶段，以建立生物的高分辨率遗传图和物理图为主。功能基因组学则代表基因组学发展的新阶段，是利用结构基因组学所提供的信息，发展和应用新的研究方法，从单一基因或蛋白质的研究转向多基因和多蛋白质的综合研究的一门学科，又被称为“后基因组学”。植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能，其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式生物，近年来小麦的功能基因组学研究也在进行，主要集中于基因组中转录表达的部分。

如何快速高效的从基因组中获取生物信息，是一个急迫并且有挑战性的课题。然而，表达序列标签（Express Sequence Tags，EST）的出现成为结构基因组学和功能基因组学连接重要依据。EST是从cDNA序列中获得的有特异性特征，能特指某个基因，它的发展成为功能基因组学发展的基础，Genbank中积累的大量EST序列不仅为新基因的发现提供帮助，而且为开发基于PCR的各种分子标记提供资源，如EST-SSR，CAPS，SNP，SRAP和TRAP等。截止2015年数据库dbEST中的主要信息统计如表1所示。

dbEST中植物方面的EST主要信息（截止2015年12月）

SSR标记又称为微卫星标记，是1-6个核苷酸序列的简单重复，广泛存在于真核生物中。随着功能基因组学的发展，公共数据库中大量的EST序列为SSR的开发提供了巨大的支持。首先，避免了传统SSR标记开发所需要的构建基因组文库的繁琐步骤，并且从EST中挖掘出的SSR只是附属物，节省了大量的人力物力。其次，EST-SSR标记具有天然与功能基因表达相关的重要作用，且这种联系具有普遍性，因此利用这种标记做遗传图更快捷更准确。

1.1 EST-SSR simple sequence repeat

SSR标记又称为微卫星标记，是1-6个核苷酸序列的简单重复，广泛存在于真核生物中。随着功能基因组学的发展，公共数据库中大量的EST序列为SSR的开发提供了巨大的支持。首先，避免了传统SSR标记开发所需要的构建基因组文库的繁琐步骤，并且从EST中挖掘出的SSR只是附属物，节省了大量的人力物力。其次，EST-SSR标记具有天然与功能基因表达相关的重要作用，且这种联系具有普遍性，因此利用这种标记做遗传图更快捷更准确。

1.2 CAPS（cleaved amplified polymorphism sequences，酶切扩增多态性序列）标记

酶切扩增多态性序列又称为PCR-RELP，它是根据EST或是已经发表的基因序列等设计特异性引物，将特异PCR与限制性酶切性相结合而检测多态性的一种技术。与传统RFLP技术一样，CAPS技术检测的多样性也是酶切片段大小的差异，结果较为稳定可靠，且表现共显性。与以杂交为基础的RFLP相比，它具有如下优点：（1）引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖凝胶电泳分析；（2）在真核生物中，CAPS标记呈共显性，可以区分纯合基因型和杂合基因型；（3）所需用的DNA量少；（4）结果稳定可靠，且操作快捷自动化程度高。

1.3 SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）标记

单核苷酸多态性是指染色体基因组水平上某个特定位置单碱基的置换或插入缺失引起的DNA序列多态性。其中置换是最常见的类型。SNP被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记。它的发现途径有两种：一是对同源DNA片段测序或直接利用现有的基因与EST序列，通过序列比对，获取多态性的位点。通过特异PCR扩增和酶切相结合的方法进行检测；二是由于SNP通常变现为二等位多态性，也可以直接应用高通量快速的DNA微阵列、DNA芯片技术等高新技术来发现与检测生物基因组或基因之间的差异。

1.4 SRAP sequence-related amplified polymorphism

相关序列扩增多态性是一种新型的基于PCR的标记系统，又称为基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。引物设计是SRAP分析的核心。它共有两套引物为正向引物和反向引物。正向引物中使用CCGG序列，其目的是使之特异结合ORF中的外显子，反向引物中使用AATT序列，以特异性结合富含AT区，这样就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记。

1.5 TRAP target region amplified polymorphism

靶位区域扩增多态性也是一种新型的基于PCR的分子标记。TRAP标记技术是基于SRAP发展而来的，但与SRAP、RAPD和RFLP等标记技术无需任何序列信息即可直接PCR扩增不同，它是基于已知的cDNA或EST序列信息的。TRAP是使用长度为16-20核苷酸的固定引物和任意引物，固定引物以公共数据库中的靶EST序列设计而来，任意引物与SRAP所用一样，为一段富含AT或GC为核心，可与内含子或外显子区配对的随机序列。

2.1 建立突变体库的研究方法

基因功能分析的传统并且有效的方法之一就是利用突变体。传统的物理化学诱变来产生突变体的方法效果差且浪费资源，现在有另一种方法就是利用插入突变，即利用转座子（主要是玉米的Ac/Ds,En/Spm或Mu转座子）或根癌农杆菌的T-DNA随机插入染色体，以获得失去功能的突变体。由于插入序列是已知的，我们可以用各种克隆或PCR技术鉴定基因。目前已经在例如拟南芥、牵牛花、金鱼草、番茄、水稻中获得了一些插入突变体。

2.2 反向遗传学方法应用

虽然说研究基因功能最直接的方法是在获得失去功能的基因突变体后研究该突变体的表型，但是，在植物中利用同源重组方法很有难度，不利进行。所以我们必须另避蹊径。在得到插入突变体后，可以用寡核苷酸引物做PCR来检测插入突变，在群体中大规模筛选突变体株系。通过DNA-RNA杂种可能产生点突变，通过把终止密码子引入重复基因的保守区域，可能产生多基因家族的若干个无义突变。嵌合寡核苷酸技术可能是定点突变的有效方法之一，嵌合寡核苷酸的一条链含有与目标基因互补的5个内部核苷酸（仅为了使突变的碱基不配对），引入单碱基突变的基础是DNA修复酶识别不配对的碱基与否。

我们知道代谢组的成分中代谢产物是基因表达的终产物，代谢组是一个细胞或组织的生物化学表现型，代谢产物的水平是由代谢途径中所涉及的所有酶的活性以及作用于这些酶的效应物所决定的。所以从理论上来说，代谢组学分析所提供的信息更直接的揭示基因和表现型之间的关系，达到检测和推断基因功能的目的。对于转基因生物和敲除突变体来说，代谢组分析意义重大。因为转基因生物和突变体往往没有明显的表型变化，比如拟南芥中就含有90%的沉默突变。人们很难通过表现型的变化来确定有关基因的功能。然而，转基因生物和敲除突变体中某些代谢产物的产量和组成却会发生改变，通过代谢产物水平的变化分析，就可以把它们和野生型区分开来。所以除了从mRNA和蛋白质水平外，从代谢组学分析中也能研究功能基因组学。

图1 大规模代谢组学分析的流程

人们发现在生物体内普遍存在一种保守的基因转录后沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。这种PTGS可以由外源或内源的双链RNA降解为21-25个碱基的干扰性RNA（即small stranded RNA，siRNA），从而引发生物体细胞内同源mRNA的特异性降解，这种机制叫做RNA干扰。利用这种干扰机制发展起来的技术则成为RNAi技术。流程图如下。

图2 RNA干扰的机制流程图

RNA干扰现象现在广泛应用于抑制真核生物的一些基因的表达，从而为解析基因的功能开辟了新的途径。与反义RNA表达技术和基因敲除技术相比较，RNAi技术具有明显的优点：能够强有力地抑制序列特异性的目的基因的表达，抑制率很高，操作简便迅速，耗费的精力和财力较小。

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