今天跟大家分享的是发表在Nature（IF: 49.962）上的一篇文章。T细胞浸润程度对免疫治疗响应有关键作用，在本篇文章中，研究者提出一种基于DNA测序估计T细胞分数的方法。T细胞受体切除环（TRECs）的缺失是T细胞成熟所需要的，其通常在V(D)J重组过程中会发生；通过对TRECs的缺失打分，研究人员就能准确估计出肿瘤中存在的T细胞数量；这个分数还能被用来预测患者对检查点抑制剂（CPIs）的响应以及免疫逃逸机制。

Using DNA sequencing data to quantify T cell fraction and therapy response

基于用DNA测序数据量化T细胞分数和治疗反应

1.从全外显子测序（WES）数据推断T细胞分数

T细胞多样性是免疫系统识别外来抗原所必需的，是V(D)J重组的产物（T细胞受体基因片段重组）。T细胞受体的α-链是由TCRA基因编码的，V(D)J重组的结果是将TCRA中未选择的基因片段切除变成TRECs-TCRA，因此在T细胞内发生缺失事件。

用来推断癌症体细胞拷贝数变化(SCNA)的工具依赖于读取深度比(RDR)，反映肿瘤样本与其匹配对照之间读取比率的对数。在TCRA中检测到的大多数SCNA反映的是相对T细胞含量的信号，为利用这一信号来量化T细胞含量，研究者开发出T细胞ExTRECT，它使用TCRA中的改良RDR直接量化WES样本中的T细胞浸润(图1a)，即TCRA T细胞分数。与来自RNA测序(RNA-seq)数据的方法不同，TCRA T细胞分数是对样本中T细胞比例的直接量化。TCRA T细胞分数不依赖于样本是否新鲜，冷冻或福尔马林石蜡包埋(FFPE)。因此,T细胞ExTRECT可以适用于肿瘤或血液样本。

2. TCRA T细胞组分的验证

为评价T细胞ExTRECT的准确性，研究者采用五种正交方法。

首先,该研究能够评估T细胞是否存在于某个样本中,研究者使用自T细胞淋巴瘤和来自于HCT11的结直肠癌细胞系数据。在所有的HCT116细胞系中，T细胞组计算分数为0。相反，来自T细胞淋巴瘤的三个细胞系得分接近1。

其次，研究者使用一种基于DNA的替代方法(CDR3 V(D) J评分)来推断免疫含量。研究者观察到TCRA T细胞分数与CDR3 V(D) J评分之间存在显著正相关。然而，CDR3 V(D)J评分受测序深度的限制;与CDR3区域对齐的读取数量通常非常低。

第三，研究者利用一系列的T细胞片段模拟下一代测序数据，观察到模拟的和计算的T细胞分数之间高度相关。基于模拟，研究者发现TCRAT细胞分数估值在覆盖范围上保持一致。当选择5个CDR3覆盖率最高的样本并将样本降到50个时，CDR3方法的结果发生严重倾斜。

第四，为进一步确认TCRA T细胞分数用于量化T细胞的准确性，研究者评估其与苏木精和伊红染色组织来源样本中的TIL评分的相关性。选择具有RNA-seq数据和组织病理学来源的TIL评分的肿瘤样本数据，研究者评估TCRA T细胞分数、CDR3 V(D)J评分和基于RNA-seq的CD8+细胞免疫比例(TIMER，CIBERSORT等)与组织病理学得出的TIL评分进行比较(图1b)。Danaher CD8+评分相关性最强，其次便是TCRA T细胞分数。

最后，研究者将WES的TCRA T细胞分数与RNA-seq方法直接进行比较，发现与多个免疫评分间存在显著正相关关系，其中与T细胞相关分数相关性最强(图1c)。

图1. T细胞ExTRECT方法及其验证

3. 血液中T细胞含量的影响因素

接着，研究者在匹配的对照血液WES样本中探索T细胞免疫浸润的关键影响因素。

在TRACERx10013队列中，女性血液TCRAT细胞比例显著高于男性(图2a)。与肺腺癌(LUAD)患者相比，肺鳞状细胞癌(LUSC)患者血液T细胞分数有升高的趋势。研究者还观察到血液中TCRA T细胞分数和匹配的肿瘤TCRA T细胞分数之间存在显著的正相关关系(图2 a)。这些数据表明肿瘤免疫浸润可能影响循环血液中的T细胞水平，反之亦然。研究者在TCGA 中的LUAD和LUSC的数据中可观察到一致结果。

为进一步研究血液T细胞分数的决定因素，研究者从血液和正常的食管上皮(PNE)组织中提取WES数据。虽然血液样本表现出广泛的TCRA T细胞比例水平,大多数PNE组织没有检测到T细胞浸润。通过T细胞浸润来分割PNE样本，发现其与血液TCRA T细胞分数显著相关(图2 b)。因此，与肿瘤样本相似，正常组织中高水平的T细胞浸润可能会影响或受血液中观察到的TCRA T细胞碎片的影响。在预测血液中T细胞比例的线性模型中，只有正常组织中的浸润水平是显著的;没有基因组因素，如正常的组织突变负担或驱动突变状态被用于预测PNE组织中的T细胞浸润。

为探索病毒或细菌感染对血液中T细胞水平的影响，研究者对TCGA中LUAD和LUSC的肿瘤和血液的微生物丰度进行标准化估计。微生物读数升高的血液样本具有明显较高的TCRA T细胞分数(图2c)。

在肿瘤样本中没有发现相应的关联。没有特定的病毒或细菌与血液TCRA T细胞分数相关。

4. 肿瘤T细胞含量的影响因素

接着，研究者对肿瘤组织中T细胞浸润的影响因素进行探索。研究者基于最近发表的泛癌数据对免疫浸润异质性的程度和可能的基因组基础进行探究，评估了来自12种癌症类型178个肿瘤的731个样本的T细胞浸润情况。

研究者将每个多样本肿瘤分为均匀热(所有样本TCRA T细胞分数>0.11)，均匀冷(所有样本TCRA T细胞分数>0.11)或异质性。不同类型肿瘤所占比例差异有统计学意义(图2d)，其中雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌(BRCA)肿瘤异质性最大(83%)，而LUSC肿瘤异质性最小(22%)。不同类型癌症在免疫浸润异质性方面存在明显差异，比如64%的BLCA肿瘤均为免疫热，0%均为免疫冷，而在LUAD中，37%的肿瘤均为免疫冷，25%均为免疫热。

接着，研究者对SCNA和免疫多样性之间的关系进行探索。研究者将分析限制在至少有三个样本和T细胞浸润的异质混合物的肿瘤患者中。任何两个样本之间的成对SCNA异质性为任一样本中具有独特SCNA的基因组所占比例的总和。与TCRA T细胞分数异质性较低的配对样本对相比，TCRA T细胞分数差异较大的成对肿瘤样本在SCNA异质性上有较大的差异(图2e)。

为探究与免疫衰竭或激活相关的特定亚克隆SCNA，研究者在泛癌多样本队列中识别出30多个肿瘤亚克隆缺失或获得相关的细胞带，并研究特定的SCNA是否与TCRA T细胞片段的变化相关。发现12q 24.31 32亚克隆缺失与TCRA T细胞分数下降显著相关(图2 f)。

对TRACERx100队列的RNA-seq分析发现，在有和没有亚克隆12q24.31 32缺失的样本中，SPPL3的表达差异最显著。已发现SPPL3的缺失可增强B3GNT5酶活性，上调细胞表面鞘糖脂，进而阻碍I类HLA功能，降低CD8+ T细胞活化等。因此，以上数据表明，包括SPPL3在内的12q24.31亚克隆缺失可能是潜在的一种免疫逃避机制。

图2. T细胞分数的影响因素

5.T细胞分数在LUAD中的预后作用

为探索T细胞ExTRECT的临床应用，研究者在TRACERx100的非小细胞肺癌(NSCLC)数据中验证TCRA T细胞分数的预后作用。根据TCRA T细胞分数在队列中的平均值，研究者将肿瘤样本分为冷热两种类型。在LUAD中，研究者观察到，免疫冷肿瘤样本数量升高的患者预后明显较差(图3)。在LUSC患者中，不同T细胞分数患者之间的生存率没有显著差异。

图3. TCRA T细胞组分对LUAD的预后价值

6. T细胞组分对CPIs的响应

为进一步探索T细胞ExTRECT的临床应用，研究者对T细胞组分与CPIs的临床反应之间的关系进行探究。CPI1000+队列包括1070例接受抗CTLA-4、抗PD-L1或抗PD-1治疗的8种主要类型肿瘤患者。根据RECIST的影像学标准将患者定义为响应者或无响应者。

研究者察到应答者中肿瘤TCRA T细胞的分数显著更高(图4a)且免疫冷性肿瘤在无应答者中显著富集(图4b)。另外，TCRA T细胞分数和临床反应之间的关联与克隆TMB无关(图4b)。为评估T细胞ExTRECT的有效性，研究者选择同时包含RNA-seq和TCRA T细胞组分数据，且包括至少10个样本的癌症类型进行单变量meta分析(图4c)。研究结果表明，TCRA T细胞组分、克隆TMB和CD8A表达均与CPIs反应显著相关。

为评估肿瘤TCRA T细胞片段是否能比CD8A表达更大程度地提高对CPIs应答的预测能力，研究者评估了不同的线性模型。单克隆TMB + TCRA模型明显优于单克隆TMB模型。当检验所有模型变量的显著性时，TCRA T细胞分数比CD8A更显著，当组合成多变量模型时，TCRA T细胞组分仍然显著，但CD8A表达不显著。最后，研究者评估TCRA T细胞组分在接受CPI 治疗的NSCLC队列中的预测潜力。在单变量分析中(图4d)， TCRA T细胞分数和血液TCRA T细胞分数与CPI反应显著相关。

这些结果表明，TCRA T细胞分数可以作为RNA-seq测量CD8+浸润的替代品，TCRA T细胞分数增加TMB的预后价值。

图4. TCRA T细胞分数可预测免疫治疗反应

今天的内容就是这些，最后让我来总结一下吧。研究者基于对TRECs的缺失打分，构建T细胞组分分数；T细胞组分分数与LUAD患者预后和患者对检查点抑制剂（CPIs）的响应高度相关。本研究的核心原理是当T细胞成熟时，编码T细胞受体的基因在可变区会发生重排，切掉部分序列；通过该区域序列丢失情况，对样本中T细胞的丰度进行量化。该方法相对便捷，且成本较低，具有重要的肿瘤研究以及应用价值。

看了nature上的工作，小编不禁再次感叹，自己啥时候才能想出这么精彩的思路，做出这么有创新性的假设呢。。。看来要想文章发的多，平时积累少不了啊，大家彼此共勉吧。