今天要给大家介绍一篇2021年10月份发表自Frontiers in Immunology(IF: 7.561)，在该研究中，作者使用单细胞RNA测序数据鉴定了在胃癌发展过程中不同组织微环境细胞的动态转录组图谱。

A Dynamic Transcriptome Map of Different Tissue Microenvironment Cells Identified

During Gastric Cancer Development Using Single-Cell RNA Sequencing

文章简介

在全球范围内，胃癌(GC)是第五大最常见的癌症肿瘤。GC的发展经历了一个多阶段的过程，从非萎缩性胃炎(NAG)到慢性萎缩性胃炎(CAG)，再到肠上皮转化(IM)，最后是GC。在此过程中，胃黏膜组织和组织微环境（TME）发生动态变化。TME包括多种细胞类型（免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等）和围绕上皮细胞的基质成分（趋化因子、细胞因子、生长因子等）。人们越来越认识到，TME的细胞特征在使肿瘤增殖和转移方面发挥着重要作用。有研究表明，TME细胞不是随机分布的，而是更多或更少的密集地分布在上皮细胞不同的区域，形成了促进肿瘤生成的复杂背景。有结果表明，癌症中的TME细胞动力学严重影响疾病生物学，并可能影响对全身治疗的反应。此外，TME与癌细胞之间的相互作用可以促进表型异质性、细胞可塑性和癌细胞干性，改善肿瘤的侵袭和转移。因此，阐明TME细胞中的动态转录组变化对于确定与GC病因有关的机制很重要。

目前已经通过大量RNA转录组测序确定了GC中的TME变异。一些文献表明复杂TME已严重削弱抗肿瘤免疫能力。胃黏膜固有层中浸润的免疫炎症细胞在GC发展过程中表现出动态变化。然而，这些分析的原理是基于每个基因在每个细胞中均等表达的假设。因此，进行传统的RNA测序是不可能在亚群水平上研究TME细胞的异质性的。

单细胞RNA转录组测序(scRNA-seq)可以用于研究细胞异质性并预测和分析细胞间的相互影响。该技术在分析复杂的细胞环境和破译疾病多个阶段之间细胞的变化表现出良好的实用性。到目前为止，关于这个主题的出版物很少。在GC进展过程中TME细胞的变化尚未阐明，因此，scRNA-seq可以帮助确定特定的细胞亚群和转录特征以在胃病的发展中区分TME细胞。

在这项研究中，作者使用单细胞测序数据可视化了疾病多阶段期间（NAG-CAG-IM-GC）几种TME细胞类型的动态转录组图。该图谱确定了不同疾病状态下不同TME细胞的多维特征，包括亚群、标记基因、功能通路、分化拟时、激活的转录因子(TF)、免疫检查点和细胞间通讯模式等。作者的分析揭示了在GC肿瘤形成过程中，TME细胞中巨噬细胞、T、B、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞的异质性显著增加，并有可能为GC的早期检测、诊断和治疗制定策略。

文章结果

TME细胞的表达谱和不同疾病阶段的变化趋势

为了表征胃微环境的单细胞概况，作者从NAG、CAG、IM和GC阶段获得了66,063个单细胞。质量控制后，剩余45,336个细胞。为了识别不同的细胞群，作者使用Seurat来执行降维、消除批次效应并进行无监督模块聚类。基于经典标志物的表达，作者排除了13个上皮细胞亚群，鉴定了11个TME细胞亚群，包括T细胞（CD2和CD3D）、B细胞（CD79A）、巨噬细胞（CSF1R和 CD68）、肥大细胞（TPSAB1）、成纤维细胞（DCN和PDPN）、内皮细胞（VWF和ENG）和周细胞（RDGFRB和RGS5）（图1A，B）。在NAG-CAG-IM-GC级联过程中，T细胞比例显着增加，尤其是在GC阶段，B细胞和EC显着减少。巨噬细胞、周细胞、肥大细胞和成纤维细胞在整个级联过程中表现出轻微的波动变化（图1C、D）。

图1：不同的TME细胞群和表达特征

不同疾病状态下巨噬细胞的动态多维特征

作者根据相似和差异基因表达在四个亚群（MacC1-MacC4）中鉴定了1,162个巨噬细胞（图2A）。从CAG到IM再到GC，MacC1和MacC3的比例呈下降趋势，MacC2呈上升趋势，而MacC4在GC上有独特表达（图2C、D）。标记基因和MacC1-C4亚群功能在图2B、2E展示。与其他细胞亚群相比，MacC1有中性粒细胞激活和抗原呈递功能。MacC2有粒细胞活化、白细胞迁移和凋亡信号通路功能的调节。MacC3细胞参与膜上的蛋白质定位。MacC4显示有更高的氧化磷酸化和ATP生物合成过程的表达方式。作者还鉴定了新的标记基因PLAU、S100A8、CLEC10A和TFDP2（图2F）。这些结果表明，在NAG-CAG-IM-GC过程中，巨噬细胞亚群参与了趋化性、抗原呈递和凋亡调控。类似地，巨噬细胞在TME中被重塑以参与氧化磷酸化和ATP产生以促进GC进展。拟时分析显示MacC1细胞具有最低的伪时间值（图2G），其中MacC1细胞保持不变，而一些细胞转化为MacC2，一些经过MacC3阶段为MacC4细胞。SCENIC分析显示TFs、MSC、MECP2、BCL11A和ETS2上调，而GTF2B、CREB5、MAF、NR1H3和TCF4在转化过程中下调。（图2H)。

图2：不同阶段巨噬细胞组成、基因表达及功能的变化

不同阶段T细胞的动态多维特征

作者根据已知的标记基因确定了四个T细胞亚群，分别称为CD8+ T、CD4+ T、Treg和自然杀伤(NK)T细胞（图3A、B）。在从NAG到GC阶段的级联过程中，CD8+ T和CD4+ T细胞逐渐减少并被Treg和NK T细胞取代（图3C）。大约1,213个CD4+ T细胞被另外三个亚类所代替。因此，作者对CD8+ T、Treg和NKT细胞进行了亚组分析。

图3：不同阶段T细胞亚型多重变化的特征

如图所示（图3D），CD8+ T（n=2,410）细胞被分成五个亚群（CD8+ C1-CD8+ C5）。CD8+ C1和CD8+ C3亚群的比例逐渐下降，但CD8+ C2和CD8+ C4亚群的比例逐渐增加，尤其是从IM到GC，它们显示出急剧上升的趋势（图3E、F）。CD8+ C5在不同阶段之间没有显着变化。图3G、3H显示了CD8+ C1–CD8+ C4亚群的标记基因和功能。CD8+ C1与其他亚群相比，在免疫效应过程、白细胞活化和翻译起始中发挥作用。CD8+ C3显示参与具有防御反应、对生物刺激的反应和细胞因子介导的信号通路。CD8+ C2表现出对白细胞-细胞粘附、T 细胞受体信号通路和免疫反应的正向调节的功能。CD8+ C4表现出基因CXCL13、RBPJ、TRAC、LAYN和IRS2的显着高表达（图3I），其中CXCL13和LAYN表示T细胞耗竭。值得注意的是，抑制性检查点基因，TNFSF4、TNFRSF9、TMIGD2、CD200、TNFSF15、TNFRSF4、TNFRSF18、HAVCR2、VSIR、TIGIT和CD70在CD8+ C4 亚群中被上调（图3I）。这些结果表明，在正常、癌前和癌症阶段之间，一部分CD8+ T细胞被耗尽并被免疫抑制，而另一部分则主导了免疫反应的激活以抵抗肿瘤细胞。

如图（图4A），478个Treg细胞分为两个亚群TreC1(FOXP3-、IL2RA+)和TreC2(FOXP3+、IL2RA+)（图4B），其中大部分来自GC阶段（图4C）。与TreC1亚群相比，TreC2亚群中的DEG参与氧化磷酸化和Th17细胞分化过程（图4D）。此外，这些细胞表达了几个免疫检查点（TIGIT、VSIR、HAVCR2、CD48、TMIGD2、CD80和CD44）和共刺激分子（TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF18、CD27、CD70和ICOS)（图4E），表明在致癌作用中的重要作用。进一步的分析表明，SH2D1A是TreC2亚群的代表性基因（图4B）。FOXP3和SH2D1A显示出很强的相关性（P<0.001，R=0.7，图4F），然而，它们之间没有观察到直接的相互作用（图4G）。

图4：Treg和NK T细胞亚群

作者将452个NK T细胞分为两个亚型（C1和C2），其中大部分来自肿瘤组织（图4H、I）。图4J，4K显示了标记基因及其功能。C1的主要功能与蛋白质定位于内质网、RNA分解代谢过程和翻译起始（图4K）有关，这表明了NK T细胞的活化。C2与免疫和细胞防御反应有关，表明具有抗肿瘤反应的潜力（图4K）。一些抑制分子（TIGIT、HAVCR2、TMIGD2、CD48、CD44）和共刺激分子（TNFRSF9、TNFRSF18，TNFSF14）在这些亚群表达（图4L）。

B细胞不同阶段的动态多维特征

总共2573个B细胞被分成四个亚群(C1-C4)，其中大部分来自炎症阶段（图5A、B）。作者发现C1和C3亚群在CAG阶段逐渐增加，然后随着疾病进展而下降（图5C）。C4亚群只出现在GC阶段。图5D、5E显示了标记基因及其功能。C1与对细菌的反应和消化功能有关。C2亚群参与鞘糖脂分解代谢过程和涉及内质网相关降解(ERAD)途径负调控的过程。C3与细胞因子介导的信号通路以及对cAMP和细菌的反应有关。C4亚群参与p53对内在凋亡信号通路的正调节和泛素连接酶活性的负调节相关的功能。这些结果表明，B细胞在炎症阶段积极参与免疫反应，但在癌症阶段失去功能，有诱导细胞凋亡的趋势。

拟时分析显示C2细胞是具有最低伪时间值的起点。C3和C4出现在分化拟时的每一端（图5F）。SCENIC分析表明，许多关键基序的活性，包括STAT3、FOXP1、TGIF1、YY1和REL被激活，而FOS、EPAS1、EGR1和JUN被抑制，从而导致C2-C4过程（图5G）。

图5：不同阶段B细胞亚型多重变化的表征

非免疫细胞不同阶段的动态多维特征

接下来，作者评估了TME中非免疫细胞的转录组转换，总共有1,730个成纤维细胞根据不同的基因表达模式被分成五个亚群(FibC1-C5)（图6A）。FibC1亚群细胞在CAG阶段占主导地位，而FibC2和FibC4亚群在IM阶段逐渐增加。FibC3亚群仅出现在可能与肿瘤相关的GC阶段，而FibC5在所有阶段细胞数都较少（图6B、C）。图6D显示了所有亚群的标记基因和功能。GO分析表明对生长因子的反应在FibC1（图6E）中高度富集，尤其是BMP4（图6F））。炎症反应、补体激活、细胞凋亡和蛋白水解调节过程在FibC2和FibC4中显着更高（图6E）。心血管发育、胶原纤维组织和细胞粘附过程在FibC3中高度富集（图6E）。作者还观察到新的标记基因（图6G），其中RBP4、ABCA8和GPM6B主要在CAG阶段；CST1主要出现在GC阶段，NPY主要出现在IM阶段（图6H）。为了确认表达，进行了免疫荧光测定，如图6K-N所示在胃病的不同阶段，RBP4、S100A8、NPY 和CST1与传统的成纤维细胞标记物(ACTA2)共表达。RBP4、S100A8、NPY多出现在CAG和IM期，而CST1+成纤维细胞几乎只出现在GC期，NAG组织中几乎不存在。

图6：不同阶段成纤维细胞亚群的鉴定和表达特征

拟时分析显示FibC2细胞在分化最初阶段，FibC3在分化最后阶段（图6I）。SCENIC分析显示拟时趋势可能受NR2F1、TCF21、FOXF1和SOX6表达降低的调节，而STAT1、STAT2、FOXP1、FOXO1和NR2F2表达上调（图6J）。TF的变化可能是细胞发育机制的关键。

从1,115个细胞中鉴定出四个内皮细胞亚群(EndC1-C4)（图7A）。EndC1亚群在肿瘤发生过程中逐渐减少。EndC2亚群在GC中略有增加。EndC3亚群细胞是IM的主要细胞，而EndC4亚群仅出现在GC（图7B、C）。EndC2亚群显示具有高度表达的线粒体基因并且没有特定基因表达（图7D）。EndC3亚群与TGF-β信号传导、血管生成和EMT（上皮-间质转化）呈负相关。EndC4集群主要与G2M检查点、MYC和EMT进程相关（图7E）。此外，EndC4显示出显着增加的趋化因子表达（CCL18、CCL3、CCL8、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL2、CXCL5、CXCL9和PPBP）（图7F）。新的标记基因CA4主要出现在CAG阶段，而DARC在IM中出现，IGFBP5主要在GC阶段增加（图7G，H）。

拟时分析显示EndC1细胞在分化最初阶段，而C3和C4亚群出现在分化的；另外两端（图7I）。从EndC1-C3过程中，SCENIC分析表明由PRDM1、HES1表达下调，FOXC1和NR2F2上调（图7J）。

图7：不同阶段内皮细胞亚群和表达特征的识别

构建IM/GC的TME-上皮调控网络

为了进一步探索TME和上皮细胞之间的相互作用，作者使用Cellchat在IM和GC阶段构建了TME-上皮网络。如图所示（图8A），巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞在IM阶段对肠上皮细胞发挥最强作用。在GC中，巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞发挥了最强的作用（图8B）。此外，作者在每个细胞亚群中选择了10个最强的LR相互作用。在IM阶段（图8C），三个TME细胞组在肠上皮细胞中均高表达B2M，TFRC和HLA-F相互作用。然而，在GC中，TME和GC细胞之间的分子相互作用发生了改变，尤其是在成纤维细胞中。成纤维细胞中高表达的COL1A1、COL1A2和COL3A1主要与GC细胞中的ITGA2、DDR1、ITGB1和CD44相互作用（图8D）。此外，巨噬细胞和内皮细胞在GC阶段分泌的细胞因子水平升高，因此，作者分析了这些细胞因子与GC细胞之间的相互作用。这些数据表明细胞因子主要与GC细胞表面的SDC1、SDC4和ITGB1相互作用（图8E)。

图8：TME通过LR与肠上皮细胞和癌细胞相互作用

文章小结

在这里，作者使用公共的单细胞测序数据在多疾病阶段分析了各种TME细胞的动态转录组图谱。作者观察到一组与TME细胞致癌进化相关的关键转变标记。其中，巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞对上皮细胞产生了相当大的影响，表明这些细胞可能是促进GC发生和发展的关键TME因素。