免疫细胞浸润作为I-III期结肠癌诊断和预后的生物标志物Immune cell infltration as a biomarker for the diagnosis and prognosis of stage I–III colon cancer肿瘤浸润性免疫细胞是可切除结肠癌患者的重要预后信息来源，为了改善结肠癌的早期诊断和预后预测，在研究中采用了通过估计RNA转录物的相对子集的细胞类型鉴定（CIBERSORT），基于公共数据库中可获得的基因表达谱来量化结肠癌患者和正常对照样品中免疫细胞的比例，同时开发了两种新型免疫模型dIRS和pIRS，为结肠癌患者的诊断和预后提供更有效的生物标志物。通过GEO查找数据集，使用affy和simpleaffy包下载并归一化数据的原始CEL值。结肠癌数据集中包括非肿瘤结肠粘膜的mRNA表达谱，这些mRNA数据将被作为正常对照。将基因表达数据上传到CIBERSORT网站输出p <0.05的病例，使用cutoff Finder计算每种免疫细胞类型的最佳切割值。将样品随机分成训练和验证组，从数据库中收集患者的年龄，性别，TNM分期和原发肿瘤部位。基因集富集分析（GSEA）用于研究c2和c5的分子特征数据库中的潜在机制。使用R和SPSS进行统计分析，用多个插补分析处理缺失值。使用针对正态分布变量的独立t检验和针对显示异常分布变量的Mann-Whitney U检验对连续变量进行组比较。使用Spearman相关性检验分析免疫测定值与相应基因的mRNA表达水平之间的相关性。随机森林分析、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）分析都用于识别区分肿瘤和正常组织的免疫细胞。最后选择这两种方法之间的重叠标记，使用逻辑回归方法建立诊断预测模型。通过Kaplan-Meier方法计算存活率，并且使用对数秩检验确定存活曲线之间的差异的显著性。使用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析。实施LASSO-Cox方法以降低维数并选择最显著的复发相关免疫细胞，用Cox回归方法建立预后模型，根据Iasonos指南进行Nomogram构建和验证。通过临床特征（ROC）曲线和时间ROC曲线分别分析诊断和预后预测模型的灵敏度和特异性，并通过ROC曲线下面积（AUC）进行量化。通过Harrell的一致性指数（c-指数）测量和比较预后模型的区别。如图1a所示，结肠癌组织中活化的CD4 +记忆T细胞，M0和M1巨噬细胞，活化肥大细胞和中性粒细胞的比例始终高于正常组织，只有静息肥大细胞的比例显著降低。随机森林分析（图1b）和LASSO分析（图1c）揭示了两种方法之间的八个重叠标记，使用逻辑回归建立具有这些标记的诊断性免疫风险评分（dIRS）模型。图1d显示，在训练组和验证组以及整个患者组中，dIRS值在结肠癌组织中每个基因表达系列中显著上调。dIRS模型还显示出区分结肠癌患者与正常对照的高准确度（图1e，f）。评估dIRS在结肠息肉和癌症之间的分离能力，在这两种疾病之间观察到dIRS值的显著差异。dIRS模型显示超过80％的敏感性和特异性，用于鉴别患有息肉的结肠癌患者。
通过LASSO算法（图2a）选择22种类型的免疫细胞，使用Cox分析建立预后免疫风险评分（pIRS）模型。根据整个队列中获得的切割值将患者分为高或低pIRS组。Kaplan-Meier曲线表明，高pIRS组患者在训练集，验证集和整组中通过对数秩检验显著复发的风险较高（图2b-d）。当在所有患者队列中作为连续变量处理时，发现pIRS是通过多变量分析存活的强有力的独立危险因素（表1）。。在c指数分析（表2）中，pIRS模型在训练，验证和整个队列中显示出比TNM阶段更好的预测能力。
表2 Harrell在不同队列中的pIRS，阶段和列线图的一致性指数
使用来自训练组的患者构建一个整合了pIRS和临床病理因素的列线图（图3a）定量预测复发概率。图3b描绘的校准曲线显示，与使用训练群组，验证群组和整个群组的理想模型的性能相比，导出的列线图表现良好。使用决策曲线（图3c）和c-指数分析（表2），列线图显示出比TNM分期系统更好的预测准确性。
如图4a所示，除了淋巴结转移状态外，pIRS在具有不同肿瘤侵袭水平，复发发生状态和MSI状态的患者之间显著不同。就分子亚型而言，CMS3和CMS4中的患者显示出显著更高的pIRS值，而CMS1显著与低pIRS相关。图4b中描绘的热图显示pIRS显著与PD-L1，LAG3，TIGHI，GZMB和IFNG的表达水平负相关。最后进行了GSEA以阐明pIRS模型的生物学功能（图4c-e），揭示了低pIRS组中高表达的基因在多个生物过程中显示出显著的富集，而高pIRS相关基因与代谢相关基因集相关。
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