45 Illumina、Roche 454、Life Ion Torrent、SOLID和PacBio的高通量测序仪的优缺点是什么？

Illumina的测序仪的数据产量高，数据质量也是最高的。因为采用带终止基团的荧光dNTP，所以在测Homopolyer（碱基同聚物，例如一串4个T：TTTT）等的时候，不会产生移码错读。

Roche 454采用的是pyrosequencing的测序原理，通过水解DNA全成过程中所产生的焦磷，放出光，通过测这光来读出序列。优点是读长最长。但是数据产量是最低的。

Ion Torrent，包括PGM和Proton，采用测量DNA合成过程中所释放的氢离子引起的PH值的变化，来得到序列。优点是速度最快，上机前约3~4天的时间，上机只要2~4个小时。

SOLID采用的是杂交，连接反应，再测荧光的方法。因为杂交，所以速度慢，测长

较短。现在事实上已被淘汰。

PacBio是三代测序，也就是单分子测序。目前的情况是测序长度可以在1个KB以上，而且可以测出DNA序列的修饰情况。但是其缺点在于测序的准确度很低，目前的测序准确度只有每个碱基80~90%。另一方面通量较小，一次读7万条reads.

46Illumina测序过程中，Multiplex index之间会有多少交叉的污染？

曾经专门做过实验，用4个亲缘关系很远的物种的DNA，用4个index标记，进行测序。测序之后进行基因组比对，发现每种index之内会有0.02~0.03%的reads是别的物种的。也就是说因为Multiplex index引入的交叉污染，会以0.02%上下的比例存在。

这主要是由化学合成index oligo过程中的误差引起的。根据引物合成专家的经验，即使经过HPLC的纯化，oligo中还是会有0.5~1%甚至更高的错的引物。现在的0.02%的污染率，已经是很低了。

47 Hiseq和Miseq都可以做双index测序吗？

Miseq是天生就可以做双index测序的。

Hiseq要升级到2500之后，才可以做双index测序。而且，在测的时候要加一个试剂盒：Truseq Dual Index Sequencing Primer Box(下称Dual Index Box)。

这个试剂盒只能用于一整个Hiseq 2000的Flowcell，也就是说无论一张Flowcell中有几条Lane是双index的，只要其中有一条Lane是双index的，就需要用一个Dual Index Box.

Dual Index Box中主要是新加的测第2条Index的引物。