IF=38+的高质量单细胞分析文章

今天给大家分享一篇2022年9月13日发表在《Cancer Discovery》（IF:38.272）的单细胞分析。文章整体描绘了早期肺腺癌中B淋巴细胞的单细胞免疫组学景观，将浸润B细胞特征与主要的临床病理特征相关联，包括吸烟、驱动基因突变和肿瘤分期，并评估其临床意义，如患者的生存率和对免疫疗法的反应。是一篇非常值得学习的范文！

摘要：

肿瘤浸润性B细胞和浆细胞（TIBs）在肺腺癌（LUAD）中很普遍，然而它们的特征不明显。作者对16个早期LUADs和47个多区域正常组织进行了配对的单细胞RNA测序和B细胞受体测序（paired single-cell RNA and B cell receptor (BCR) sequencing ）。通过对约50,000个TIBs的综合分析，确定了LUAD和邻近正常生态系统中的12个TIB子集，并证明了LUAD中TIBs的广泛重塑。记忆B细胞和浆细胞（PC）在肿瘤组织中高度富集，具有更多的分化状态，体细胞超突变的频率增加。吸烟者表现出明显升高的PC，并有不同的分化轨迹。BCR克隆型的多样性增加，但在LUADs和吸烟者中，随着病理阶段的增加，克隆性下降。TIBs大多定位于CXCL13+淋巴细胞聚集区，产生CXCL13的免疫细胞来源随着LUAD的进展而演变，包括CD4调节性T细胞的升高部分。这项研究提供了早期LUAD中TIBs的空间景观。

背景：

肺腺癌（LUAD）是最常被诊断的肺癌组织学亚型，并占了大多数与吸烟有关的癌症死亡。因此，迫切需要在LUAD的早期阶段进行治疗的策略。由于对LUAD发病过程中肿瘤微环境（TME）的早期变化的认识滞后，这种进展受到了严重的限制。

在了解肺癌免疫生物学的努力中，T细胞一直是关注的焦点。其他细胞类型，特别是肿瘤浸润性B细胞和浆细胞（TIBs），大多被忽视，它们在实体瘤（如LUAD）发病机制中的作用仍然不为人知。TIBs已经在不同类型的实体瘤中被发现。最近的研究表明，TIBs可以强烈影响患者对抗癌化疗和免疫疗法的反应，以及包括黑色素瘤和肺癌在内的各种癌症的临床结果。在最近的单细胞研究中也发现了TIBs，但它们的表型和状态没有得到广泛的描述。可能是这些重要的研究由于测序的B细胞数量不足而缺乏对TIBs进行深入分析的能力。作者最近对5名早期LUADs患者的上皮细胞和TME细胞进行了分析，发现LUADs中的TIBs部分，包括B细胞和浆细胞（PC），相对于其匹配的正常肺组织而言有极大的增加，从而表明TIBs在LUAD发病机制中的潜在作用。

为了更好地了解TIBs在早期LUAD发病机制中的情况，作者对16个LUADs和47个匹配的来自早期疾病患者的多区域正常肺组织进行了配对的单细胞RNA测序和B细胞受体测序。研究了约7.3万个细胞的BCR和约5万个细胞的转录组，这是迄今为止关于TIBs最大的单细胞数据集。探索它们的转录状态、分化和成熟状态、空间特征、克隆型特性，以及细胞的相互作用和与其他TME细胞群的共定位模式。作者还将TIB特征与主要的临床病理特征相关联，包括吸烟、驱动基因突变和肿瘤分期，并评估其临床意义，如患者的生存率和对免疫疗法的反应。这项研究提供了对LUAD早期发展中TIB的普遍性质和功能表型的详细了解。

结果：

LUADs和匹配的多区域正常肺组织中TIBs的单细胞分析

作者对来自16个早期LUADs和47个匹配的多区域正常肺组织的细胞进行了整合的scRNA-seq和scBCR-seq，这些细胞与肿瘤的空间距离不同（即邻近的，离肿瘤边缘0.5厘米；中间的，离肿瘤边缘3-5厘米；远处的，肺叶的外围）（图1A）。与其匹配的正常肺组织相比，LUADs中EPCAM-negative（TME）细胞的B系亚群分数明显富集（图1B）。为了验证这一发现并进一步检查TIB的空间分布，作者对16名患者中的5名患者的20个可用组织进行了多重荧光（mIF）。在所有患者的肿瘤样本中都检测到了淋巴细胞聚集（LAs），包括肿瘤区和基质（图1C），以及2名患者的非肿瘤基质区。一致的是，与相匹配的正常组织相比，肿瘤中B细胞的总强度明显较高（图1D）。

作者试图定义TIBs的各种转录状态和BCR同型抗原。共有49,062个具有scRNA-seq数据的B系细胞被保留下来进行后续分析。无监督聚类显示了12个不同的细胞集群（图1E-F）。七个PC群的特点是免疫球蛋白同种型基因的主要类别和亚类别的不同表达（图1E）。PB集群的细胞是CD38 + CD138 + IgD - CD27 +，与PC相比，它们显示出相对较高的MHC II类基因的表达，以及MKI67和其他细胞周期相关基因的最高表达（图1F）。总的来说，scBCR-seq检测到的抗体同型与scRNA-seq推断的抗体同型很一致（图1E，右上角）。具体来说，幼稚型B细胞集群以IgM和IgD同型为主，记忆型B细胞集群显示出各种不同的同型，而PC集群显示出其相应的IgH同型的高度富集（图1E，G）。与PC一样，PB集群也是以IgA1/2和IgG1/2同型为主（图1G）。

LUADs中TIBs明显增加，而pc尤其在吸烟者中高度丰富

作者检查了LUADs和匹配的正常肺组织中B系细胞的丰度和细胞组成（图1H）。幼稚B细胞在全部B系细胞中的相对比例随着与肿瘤的距离增加而明显下降。相反，LUADs中记忆B细胞和PC的比例明显升高（图1I），后者在吸烟者中相对于非吸烟者尤为突出。接下来将TIB的特征与基因组数据相结合，包括肿瘤突变负担（TMB）和驱动突变。作者发现与KRAS突变型或KRAS/EGFR双野生型LUADs相比，EGFR突变型LUADs的PC比例明显较低，幼稚型和记忆型B细胞的比例较高（图1J-K）。

接下来，作者在独立的患者队列中验证观察到的结果，首先分析了Kim N et al.的大型公共scRNA-seq数据集，其中包括原发性LUADs、淋巴结和脑转移，以及从44名LUAD患者获得的正常肺部和淋巴结组织。与本文的队列一致，原发性LUADs中记忆B细胞和PC的比例明显增加（图2A）。作者还分析了Leader et al.的30个早期LUADs组成的scRNA-seq队列。作者同样发现吸烟者与非吸烟者相比，PC的比例明显增加（图2B）。作者还使用CIBERSORTx对来自TCGA-LUAD队列的大量RNA-seq数据进行了免疫反卷积分析。结果发现PC的比例在吸烟者与非吸烟者的LUADs中明显增加（图2C，左）。值得注意的是，与相匹配的正常肺组织相比，吸烟者而非非吸烟者的LUADs中PC的比例明显增加，而且戒烟15年的现吸烟者或戒烟15年以上的吸烟者的变化幅度更大（图2C，右）。这些观察结果表明PC在LUAD的免疫病理学中的潜在作用，特别是在吸烟者中。

LUADs中的高PC特征预示着更好的生存和对免疫疗法的反应

为了评估TIB的临床意义，作者利用scRNA-seq数据构建了主要TIB亚群的细胞类型特异性基因签名，并在去卷积分析中证实了其可靠性。作者还分析了TCGA-LUAD队列的大量表达数据，发现PC签名得分随着病理阶段的深入而逐渐下降（图2D）。Cox比例风险模型和Kaplan-Meier模型都显示，相对较高的PC特征分数与较好的总生存期（OS）明显相关（图2E-F）。在评估的22个免疫细胞亚群中，作者发现PC特征与TCGA-LUAD队列中较好的OS有明显的关联。

作者通过分析4个已报道的临床试验的公共数据集来评估PC特征与患者对免疫疗法反应的相关性。分析显示，治疗前肿瘤中相对较高的PC特征与抗PD-1治疗的更好反应、持久的临床获益（DCB）和明显更好的无进展生存（PFS）有关（图2G）。同样，对POPLAR和OAK这两项使用atezolizumab进行PD-L1阻断的试验的大型LUAD队列（n = 316名患者）的分析显示了非常一致的结果。相对较高的PC特征表达与抗PD-L1治疗的更好反应和改善的OS（图2H-I）明显相关。

高分化PC在LUADs和吸烟者的long-lived PC中富集

作者接下来对PC的分化状态进行深入分析。首先，用Monocle 3重建了PC的发育轨迹，伪时间分析显示了PC分化的各种不同状态，包括long-lived PCs, short-lived PCs和PB（图3A）。long-lived PCs的特点是STAT3、IKZF3（Aiolos）和CD37的高表达（图3B）。IgA/IgG转录物的表达水平也较高（图3B）。此外，为了支持他们的抗体分泌功能，大多数long-lived PCs失去了膜Ig变量（IgV）基因和BCR的表达（图3C，左）。由CytoTRACE推断的细胞分化状态与Monocle 3的结果一致（图3A），观察到随着伪时间的进展，CytoTRACE的分数逐渐下降，即分化程度增加（图3C，中间）。有趣的是，在吸烟者与非吸烟者的LUADs中，完全分化的、长寿的PC明显富集（图3C，右）。

当按抗体亚类调查PC时，IgM/IgD + PC的分化程度最低，其次是IgG3 +、IgG1 +、IgA1 +、IgG2 +，最后是IgA2 + PC，它们的得分最低（即分化程度最高）（图3D）。相对于来自正常肺组织的PC，LUADs的PC分化程度明显更高（图3E）。与基于CytoTRACE的分化推断一致，作者注意到LUAD PC中表达的基因数量相对于正常肺组织的基因数量明显较低。

LUADs中的记忆B细胞更频繁地进行类别转换并处于late-GC阶段

记忆B细胞是在生殖中心（GC）反应期间产生的，与PC分化平行（图3F，顶部），其分化在转录水平上受到严格控制。作者观察到肿瘤组织的记忆B细胞中IgA/IgG基因的表达量急剧增加（图3F，底部），表明LUADs中的记忆B细胞主要是类别转换和处于GC后期阶段。为了进一步研究LUADs中记忆B细胞的成熟状态和转录异质性，作者根据其IgA/IgG基因的表达，定义了三个发育阶段早期、中期和晚期GC阶段，然后进行CytoTRACE细胞分化分析。一致的是，与早期GC阶段的记忆B细胞相比，晚期GC阶段的细胞可能分化程度更高，表现为CytoTRACE得分明显较低（图3G）。此外，轨迹早期的记忆B细胞大多是CD27-，未转换，具有最低的BCR特征分数，并且大多来自正常的肺组织，而轨迹晚期的细胞是CD27+，转换，具有最高的BCR特征分数，并且几乎只来自肿瘤组织（图3H-I）。

沿着轨迹对前3000个可变基因的表达动态分析显示了与记忆性B细胞分化有关的不同生物过程（图3J）。作者还发现相对于早期记忆B细胞，晚期上调的基因（如XBP1、MZB1和JCHAIN）和下调的基因（如CXCR5、CCR7、CD69和BACH2），与之前报道的这些基因在B细胞分化中的作用一致（图3K），意味着LUADs中的记忆B细胞可能是在分化轨迹的晚期阶段产生。IgA1 +和IgG1 +细胞是scBCR-seq显示的最丰富的类别转换亚群（图3L，顶部），这一观察在TCGA-LUAD大型队列中得到证实（图3L，底部）。此外，还观察到IgM + /IgD +细胞的比例逐渐减少，IgA +细胞的比例增加，与LUADs的距离越来越近，因此，肿瘤组织中转换型与非转换型的比例明显增加（图3M）。结果表明，具有不同分化状态的B细胞和PC在肺部表现出不同的转录和表型特征，以及地理空间的异质性（图3I和3N）。

在LUADs、吸烟者中，BCR克隆型的多样性较高，克隆性较低，并且随着病理阶段的增加而增加。

为了更好地了解LUADs和邻近组织的免疫球蛋白重现，作者分析了在同一cDNA文库上产生的配对scBCR-seq数据，并确定了72,949个具有生产性VDJ重排的细胞。作者观察到肿瘤组织中独特的BCR克隆型的数量明显增加，即其BCR重排的多样性更高（图4A）。我们检测到肿瘤组织中扩大的BCR克隆型的数量增加，但克隆频率相对较低，即BCR复合物的克隆大小分布的不均匀性低于正常组织，在正常组织中少数扩大的克隆在复合物中占主导地位（图4B，左）。同样，还观察到吸烟者与非吸烟者相比，BCR克隆的不均匀性较低（图4B，中），而且随着病理阶段的增加，BCR克隆的不均匀性也在增加（图4B，右）。

作者测量了来自一个特定地理空间位置（如LUAD）的样本中的BCR组合与来自另一个位置（如远处的正常肺）的BCR组合的重叠情况。来自正常肺组织的BCR克隆型有38.9%与来自LUADs的BCR克隆型是共享的，相反，来自LUADs的BCR克隆型基本上是独特的，与邻近组织共享的克隆比例低得多（6.6%）（图4C）。值得注意的是，当根据LUADs中检测到的BCR克隆型是否为肿瘤所独有时，作者观察到与正常组织共享的BCR克隆型是高度扩展的，与之相反，肿瘤独有的克隆型扩展较少，主要由小克隆和单克隆组成，特别是在吸烟者中（图4D）。

肿瘤中Ig类别转换、VDJ基因使用和expanded PCs的不同情况

在这一部分，作者按照Ig亚类（即IgG3、IgG1、IgA1、IgG2、IgG4和IgA2）编码基因的基因组坐标（5’至3’）。结果表明LUADs的B细胞可能经历了独特的V(D)J重排。最后，通过整合scRNA-seq和scBCR-seq数据，发现大多数扩增克隆的细胞是PC（图4F）。扩增最多的前15个克隆几乎都被映射到PC的集群中（图4G）。

LUADs中BCR体细胞高突变（SHM）的地理空间特征

GCs中B细胞的亲和力成熟是反复几轮克隆扩增加上体细胞超突变（SHM）的结果，然后是基于亲和力的抗原特异性B细胞选择（图4H，左）。通常情况下，高的SHM频率表明有很强的抗原特异性亲和力。作者使用scBCR-seq数据量化了SHM水平，并在此基础上将细胞分为4组：非（无SHM）、低（突变频率3%）和高SHM（>3%）。作者观察到幼稚B细胞的BCR中没有SHM，记忆B细胞的BCR中有低或中等水平的SHM，而PC的BCR中有高水平的SHM（图4H，右；4I）。具有高SHM频率的细胞的克隆型大小相对较大（图4J）。罕见的IgD + PC亚群表现出最高的SHM频率（图4I），与IgD + B细胞在超级抗原驱动的GC反应中发展的假说一致。作者还观察到SHM频率随着与肿瘤的距离增加而逐渐增加，并且在切换和未切换的细胞中都是如此（图4K-L）。

B细胞趋化性CXCL13-CXCR5轴在早期LUAD发展中的作用

为了了解LUADs中TIBs的招募，作者检查了已知的B细胞吸引剂的表达，包括CXCL13，这对B细胞招募和三级淋巴结构（TLSs）的形成至关重要（图5A），以及其他趋化因子及其受体，包括CCR7-CCL19/CCL21，CXCR4-CXCL12，CXCR3-CXCL9/10/11，以及CCR6-CCL20。其中，CXCL13-CXCR5趋化因子轴似乎在早期LUADs中占优势。在LUADs中，TME细胞中的CXCL13+T细胞和CXCR5+B细胞都高度富集（图5B），并且在TCGA-LUAD队列中，CXCL13的表达也高于正常肺组织。

作者使用nanoString GeoMx digital spatial profiler (DSP) 平台对4个LUADs和配对的正常肺组织中的CXCL13蛋白（BCA1抗体）表达，并且定义T细胞（CD3）、B细胞（CD20）和肿瘤区间（泛细胞角蛋白）的线型标记物进行了表征。根据形态学标志物的表达，B细胞、T细胞或肿瘤细胞富集（图5C）。在正常肺或T/LA-/BCA-的ROI中没有或很少观察到B细胞。LA/BCA1+ROI中的B细胞数量明显增加（图5D）。为了更全面地了解LA的空间分布，作者使用Visium平台（10X Genomics）对scRNA-seq队列中两个病人的4个样本进一步进行了空间转录组学（ST）。虽然T细胞总体上是CXCL13产生的主要来源，但单细胞分析表明，大多数CXCL13+细胞是CD4 Tfh和CD8衰竭T细胞（Tex），其次是CD4调节性T细胞（Treg）和增殖性Tregs，而只有非常小的CD8效应T（Teff）细胞和CD8常驻记忆T（Trem）细胞的亚群表达CXCL13（图5E）。

然后，作者研究了LUADs中CXCL13生产的细胞来源是否随着疾病的发展和进展而演变。在这个队列和另外3个公共scRNA- seq数据集中，观察到LUADs与正常肺组织中Tregs的CXCL13+细胞的相对比例明显增加（图5F）。在TCGA--LUAD队列中也发现了CXCL13的表达增加，并注意到CXCL13的水平从正常肺到非典型腺瘤性增生（AAH），即LUAD最早的前体病变，直至浸润性LUAD（图5G，左）。一致的是，B细胞和PC特征分数也沿着这个病理谱系逐渐增加（图5G，中间和右边）。

免疫调节基因的表达和TIB表型的异质性

作者确定了有CXCL13表达和无CXCL13表达的肿瘤相关LA（分别为LA/BCA+和LA/BCA-）之间B细胞区间的免疫生物标志物表达的差异。相对于LA/BCA-ROIs，LA/BCA+ROIs的B细胞区块显示CD27、CD40的表达明显增加，CTLA-4、LAG3以及PD-L1的表达减少。此外，作者探究了TME内各种细胞群产生的细胞因子如何调节B细胞的类别转换重组（CSR）和PC的产生。然后作者量化了免疫和基质细胞亚群中诱导IgG（IFN- ，TNF）和IgA（TGF- ，IL-6和IL-10）CSR的细胞因子的表达水平（图5H）。作者将分析集中在TGFB1上，已知它在促进人类B细胞的IgA同种型转换中至关重要。虽然TGFB1被各种细胞类型广泛表达，但值得注意的是，相对于匹配的正常肺组织，TGFB1在本文的队列（图5I）和Kim等人的数据集中LUADs的癌相关成纤维细胞（CAFs）中明显更高。此外，作者利用Visium的数据进行了TGFB1表达细胞的空间映射，观察到TGFB1的强烈表达，特别是在富含成纤维细胞的空间区域，如成纤维细胞的典型标志物的高表达（图5J）。这些结果表明，CAFs中TGFB1的上调可能与LUADs中IgA+PC的比例增加有关。

记忆B细胞和IgA+ PC与CD4 Tregs和CD8 Tex强烈共存，与细胞毒性T细胞呈负相关

为了更好地了解各种TIB亚群如何影响TME的功能表型，作者首先测量了TIB亚群中免疫调节基因的表达。作者进一步检查了细胞状态与其他28个免疫和基质细胞亚群的共同关联关系，并发现记忆B细胞和IgA + PC与CD4 + Tfh、Treg和CD8 + Tex细胞强烈共存（图5K-L）。通过对大量RNA-seq数据的免疫去卷积分析，我们还观察到TCGA-LUAD队列中PC和Treg/Tex的签名分数之间的正相关关系（图5M）。这些结果表明，LUADs中TIBs和各种TME细胞之间存在明显的共同关联关系和串扰。

总结：

这项研究为肿瘤浸润性B细胞（TIBs）的转录、克隆型状态和表型提供了急需的理解，揭示了它们在早期LUADs免疫病理中的潜在作用，并为治疗这种恶性疾病的TIBs靶向免疫疗法的开发提供了路线图。文章的分析思路很不错，大家快学习起来吧！

参考文献：

Hao D, Han G, Sinjab A, Gomez-Bolanos LI, Lazcano R, Serrano A, Hernandez SD, Dai E, Cao X, Hu J, Dang M, Wang R, Chu Y, Song X, Zhang J, Parra ER, Wargo JA, Swisher SG, Cascone T, Sepesi B, Futreal AP, Li M, Dubinett SM, Fujimoto J, Solis Soto LM, Wistuba II, Stevenson CS, Spira A, Shalapour S, Kadara H, Wang L. The Single-Cell Immunogenomic Landscape of B and Plasma Cells in Early-Stage Lung Adenocarcinoma. Cancer Discov. 2022 Sep 13:CD-21-1658. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-1658. Epub ahead of print. PMID: 36098652.