ceRNA：不一样的配方，不一样的味道
生信干货
小仙女 ·2020年2月19日 02:50
今天跟大家分享的是1月份发表在frontiers in oncology(IF:4.137)上的一篇文章。虽然抗战上前线，科研工作不能断。
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Comprehensive Analysis of Competitive Endogenous RNAs Network, Being Associated With Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Its Emerging Role in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma食管鳞状细胞癌ceRNA网络的综合分析及其在头颈部鳞状细胞癌中的作用首先让我们通过摘要了解下这篇文章的主要内容，由于食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种常见的恶性肿瘤，其预后和生存率均较差。为了确定与ESCC预后相关的有意义的lncRNA，miRNA和mRNA模块，作者从TCGA中下载了ESCC中三种RNA 的数据，然后通过WGCNA分别构建了lncRNA，miRNA和mRNA共表达网络。作者一共识别了21个hub lncRNA ，7个hub miRNA 和8个hub mRNA。作者还构建了ceRNA网络，并使用多种网络工具分析了ceRNA网络在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的作用。最后作者识别出与预后有关的基因。
简要来说，作者从TCGA中检索了95个ESCC的样本的RNA测序数据，分为17份正常样本和78份肿瘤样本。从GEO中下载了与ESCC相关的基因表达谱（GSE20437和GSE38129）来对所选 hub mRNA的验证。作者对mRNA和lncRNA 进行了方差分析后选择了4938个mRNAs，3712个lncRNA 以及1881个miRNAs构建ceRNA网络。使用WGCNA构建mRNA，miRNA和lncRNA共表达网络。我们以加权mRNA共表达网络的构建为例对构建过程进行说明。首先，通过计算预处理基因间的相关性，构建相似度矩阵。然后，选择适当的β作为软阈值参数来构建无标度网络。接下来，使用TOM相似度将邻接关系转换为拓扑重叠矩阵（TOM），并计算出相应的相异度（1- TOM）并估算模块特征基因（ME）的相异度。最后，通过DynamicTreeCut算法将具有相似表达水平的mRNA归类到同一模块中。在这一部分作者想要在三个网络中找到ESCC患者的T分期和关键模块。首先，作者弄清了临床表型与MEs之间的关系，其中ME代表模块中3种RNA的表达水平。另外，作者计算了每个mRNA，miRNA或lncRNA的P值，并计算了其显著性（GS = lg P）。最后根据模块重要性选择了临床上最重要的模块。此外，通过皮尔森相关性衡量模块之间的相关性以及临床特征与三类RNA之间的关系。在构建ceRNA 网络方面，作者在每个共表达网络中选择了两个模块一个模块中的RNA表达水平与临床特征（T期）呈正相关，而另一个模块中的RNA表达水平与ESCC的T期呈负相关。作者使用DAVID对hub模块中有显著生物学意义的mRNA的进行GO以及KEGG通路分析，其中GO包含了BP,MF和CC三个类别。使用mirPath v.3对hub 模块中的miRNA进行GO和KEGG富集分析。使用基于网络的计算工具co-lncRNA对hub模块中的lncRNA进行GO和KEGG富集分析。在这一部分，为了鉴定与ESCC的发展相关的真实的hub mRNA，作者使用了三种方法来筛选候选mRNA。首先，选择与模块具有高度连接性和选定表型的mRNA作为hub模块的候选基因。然后，使用STRING分析每个hub模块中mRNA的蛋白质/基因相互作用，并选择与PPI网络中四个以上节点连接的mRNA作为候选mRNA。接下来，通过R中的survival包对每个hub模块中的mRNA进行了生存分析，选择与总体生存有关的mRNA。最后，将三部分中的共同候选mRNA视为hub mRNA。接下来就是验证部分了，这里使用了GEO 中的两套数据集GSE20347和GSE38129来验证正常组织和ESCC组织之间hub mRNA的不同表达水平。通过R包limma分别在两个数据集中识别了差异表达基因并绘制了Kaplan-Meier图，对预后标志物进行探索。根据上一步预测出的hub mRNA，作者使用TargetScan来预测hub mRNA对应的候选miRNA，选择TargetScan> 0.4作为阈值，将hub模块中| MM |（|cor. module membership|）>0.4的候选miRNAs定义为真正的hub miRNAs。然后，使用LncBase根据hub miRNA 预测hub lncRNA，并选择LncBase> 0.7作为阈值。在hub 模块中|MM| > 0.7以及通过LncBase进行预测的共同的候选lncRNAs被定义为真正的hub lncRNAs。1.7 ESCC ceRNA调控网络的构建和拓扑分析根据TargetScan和LncBase的预测，使用Cytoscape软件使用相互作用构建了lncRNA–miRNA–mRNA网络，并且还应用STRING证明了基因之间的相互作用。同时，通过Cytoscape中的“ NetworkAnalyzer”计算了lncRNA–miRNA–mRNA网络的所有节点度。1.8 ESCC和HNSCC中ceRNA网络的预后因素使用R中的survival包对ceRNA网络中的mRNA / miRNA / lncRNA进行生存分析。此外，为探究ceRNA网络在HNSCC中的作用，应用UALCAN来发现正常组织和癌组织之间的hub基因差异表达水平。使用OncomiR探究正常组织和癌组织之间hub miRNA的差异表达水平。使用t检验来探究正常和HNSCC样本中的hub lncRNA的差异表达水平。最后作者应用OncoLnc绘制Kaplan-Meier图来探究mRNA / miRNA / lncRNA的表达水平与生存时间之间的关系。作者平均链接层次聚类的方法通过R中的WGCNA 包，将具有相似表达水平的mRNA，miRNA和lncRNA分为模块，分别构建共表达网络。图2中展示了各个模块与临床特征的相关性。最后从三个网络中选出六个模块来进行进一步的分析。
在这一部分，作者探索了关键模块中mRNA，miRNA和lncRNA的生物学功能，对其进行GO和KEGG富集分析，其中GO包含BP,MF和CC（图3）。
图3.关键模块中的mRNA，miRNA和lncRNA的生物信息学分析作者使用了三种方法来识别hub mRNA，并通过jvenn绘制了韦恩图展示了三种方法共同的mRNA，最后green模块中的两个mRNA（TBC1D2和ATP6V0E1）和cyan模块中的六个mRNA（SPI1，RNASE6，C1QB，C1QC，CSF1R和C1QA）被认为是真正的hub mRNA，它们与ESCC的整体存活率密切相关（图4）。
图4. 基于TCGA-ESCC的hub mRNA表达水平之间的关联的生存分析接下来作者运用GEO中的两个数据集GSE20347 和 GSE38129使用R语言limma包来验证正常组织和ESCC组织之间hub mRNA 的差异表达水平。结果显示， TBC1D2和ATP6V0E1显著上调，而SPI1，RNASE6，C1QB，C1QC，CSF1R和C1QA显著下调（图5）。
根据miRNA共表达网络的MM和TargetScan的预测，作者将七个miRNA定义为真实的hub miRNA。根据lncRNA共表达网络的MM和LncBase的预测，将21个lncRNA视为hub lncRNA。2.5 ESCC ceRNA调控网络的构建和拓扑分析ceRNA网络涉及8个基因，7个miRNA和21个lncRNA（图6A）。此外，作者还计算了网络的所有节点度（图6C）。其中度数超过5的节点被定义为hub节点。结果作者选择了8个结点（包括3个mRNA和5个miRNA）作为hub结点。
图6 .hub miRNA和hub基因的相互作用网络此外，作者计算了miRNA–mRNA和lncRNA–miRNA之间的关系对数，结果示于表1。
表1. lncRNA–miRNA和miRNA–mRNA对的数量这个结果显示三种miRNA（hsa-miR-519e-5p，hsa-miR-515-5p和hsa-miR-6756-5p）不仅具有更高的节点度，而且具有更高的miRNA –mRNA和lncRNA– miRNA对。2.6 ESCC和HNSCC中ceRNA网络的预后因素这一部分就是最常见的生存分析啦，作者对ceRNA网络中的hub基因进行了生存分析 。其中网络中的mRNA都与ESCC的生存相关。发现一种miRNA（hsa-miR-515-5p）和一种lncRNA（XIST）与总体存活率显著相关（图6B）。此外，作者还使用一些数据库来探索ceRNA网络在HNSCC中的作用。在UALCAN的肿瘤样本中，八个基因是高表达的图（7A），并且正常和HNSCC组织之间的hub miRNA / lncRNA的表达水平无差异。在OncoLnc中，TBC1D2和ATP6V0E1与HNSCC的总体存活率呈负相关（图7B）。
好啦，这篇文章的内容就这么多啦~全国新冠形势正在慢慢的变好，不要放松警惕，依然要记得勤洗手，戴口罩不要当凑热闹哦，当然聚众搞科研也是不行的^_^，线上交流就好啦！
