哈喽，各位同学大家好~好久不见，分外想念呢。最近总有做实验的同学问我，为什么你们做生信的如此高产，5分文章轻轻松松，10分文章努力一下子也不是没有可能？ 咋说呢，可能还是因为我们多会了那么一点点生物信息学分析方法。生信文章的基础在于数据，那些在实验室不分昼夜、勤勤恳恳做实验以获取原始数据的同学是非常非常重要的。在得到原始数据后，我们要做的便是对这些数据进行处理，获取数据中的差异部分，并寻求这些差异与疾病机制，功能上的联系。生物信息入门很简单，但对那些纯做实验的同学的帮助却远不止一点点。比如前段时间，我们相继推出乳酸，焦亡，免疫，铁死亡等多个专题讨论，这些基因吸引了不少实验同学的目光，却也有很多同学不知道在自己想要研究的细胞中，癌型里该从哪个角度入手，哪组基因去做。除查阅文献等常规操作外，生物信息完全可以帮你做好前期筛选，甚至帮你确定整个实验流程。至于具体怎么做呢，还不赶紧和我一起开始今天的学习。下面，小编将从lncRNA，mRNA，miRNA，蛋白质组学等几个具体实例来帮助大家更好的理解生物信息在实验中发挥的巨大作用。

角度一：基于差异表达分析锁定疾病进程中的关键LncRNA，进一步通过分子网络构建，通路富集分析等常用生物信息学分析方法确定与LncRNA相关的调节因子以及其生物学功能，并最终通过实验，分别从目标LncRNA的过表达和沉默两方面对LncRNA的功能以及生物信息学预测机制进行验证。

LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation

LncRNA CTD-2528L19.6通过减轻成纤维细胞激活阻止IPF进展

（Cell Death and Disease，8.4685）

该研究首先基于差异表达分析识别IPF（特发性肺纤维化）致病性LncRNA和IPF进展型LncRNA，并构建IPF致病和进展LncRNA- mRNA的共表达网络。通过网络分析发现关键LncRNA CTD-2528L19.6，该lncRNA通过介导纤维化相关基因的表达调控成纤维细胞在IPF进展中的激活。研究者进一步基于实验证明沉默CTD-2528L19.6可在mRNA和蛋白水平上增加Fn1和Collagen I的表达，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，加速MRC-5细胞的迁移和增殖，而CTD-2528L19.6过表达则可减轻TGF-β1诱导的MRC-5细胞成纤维细胞的激活，以及LncRNA CTD-2528L19.6可以通过调节LRRC8C的表达抑制成纤维细胞的激活。

IPF致病特征和IPF进展特征的识别（图1）：基于生物信息学方法分别识别(1)早期IPFvs正常IPF;(2)晚期IPF vs正常;(3)晚期IPF vs早期IPF三类情况下的差异表达mRNA和LncRNA。其中，两个LncRNA和48个mRNA在三种比较中均检测到显著差异表达。有趣的是与正常样本相比，LncRNA CTD-2528L19.6、NR2F1-AS1在早期IPF患者中显著上调，然而相较于早期IPF患者而言，在晚期IPF中又发生显著下调，并且在晚期IPF中的表达水平仍高于正常肺组织。DCLRE1C、S100A8、THBS1等基因在正常、早期和晚期IPF中表现出表达逆转趋势。与正常样本相比，在早期和晚期IPF中存在差异表达的43个差异LncRNA和835个差异mRNA被定义为IPF致病特征。与正常和早期样本相比，在晚期IPF中发生差异表达的14个差异lncRNAs和264个差异 mRNA被定义为IPF进展特征。研究者发现所有IPF进展相关lncRNAs在正常肺向早期IPF过渡过程中均急剧上调，并有反弹趋势。IPF进展相关lncRNAs的表达在向晚期IPF过渡过程中明显下调，但仍高于正常肺。IPF进展相关mRNA中也观察到类似的反弹趋势。

图1. IPF致病特征和IPF进展特征的识别

构建IPF致病相关共表达网络（图2）：为捕获IPF发病机制的核心lncRNA-mRNA调控模块，研究者构建IPF致病相关共表达网络。致病共表达网络中出现以CTD-2528L19.6为核心的子网络。IPF致病网络中上调的mRNA参与原发性免疫缺陷、轴突引导和T细胞受体信号通路，下调的mRNA则主要参与癌症和癌症相关信号通路。

图2.构建IPF致病相关共表达网络

构建动态IPF进展lncRNA-mRNA共表达网络：为探索IPF进展的动态调控机制，研究者分别构建IPF早期特异性lncRNA-mRNA共表达网络和晚期特异性lncRNA-mRNA共表达网络。在IPF早期特定网络中，CTD-2528L19.6与 15个mRNA存在共表达。在IPF晚期特定网络中，CTD- 2528L19.6与6个mRNA存在共表达（图3）。在两个网络中与CTD-2528L19.6相关的LRRC8C已被证实为IPF生物标志物，并有多个与CTD-2528L19.6表达相关的基因属于纤维化相关基因 (图4)。这些结果强调CTD-2528L19.6和LRRC8C在IPF动态进展中的调控关系。

图3. IPF早期和晚期的共表达网络

图4. IPF进展中与lncRNA共表达的mRNA属于纤维化相关基因

CTD-2528L19.6与成纤维细胞基因表达负相关：为探讨CTD-2528L19.6与纤维化的关系，研究者对CTD-2528L19.6与6个IPF细胞特征基因进行相关分析，发现CTD-2528L19.6与6个IPF细胞特征基因表达负相关（图5）。

图5. CTD-2528L19.6与成纤维细胞基因表达负相关

沉默CTD-2528L19.6可促进MRC-5细胞成纤维细胞的活化：锁定CTD-2528L19.6，并在细胞系水平上探究其在MRC-5细胞成纤维细胞活化中的作用（图6）。

图6. 沉默CTD-2528L19.6可促进MRC-5细胞成纤维细胞的活化

CTD-2528L19.6过表达可减轻TGF-β1诱导成纤维细胞的活化：沉默做完，做激活，不出意料成纤维细胞活化程度被大大减轻。

图7. CTD-2528L19.6过表达可减轻TGF-β1诱导成纤维细胞的活化

沉默LRRC8C可减轻CTD- 2528L19.6对成纤维细胞活化的抑制作用：在共表达网络中，CTD- 2528L19.6表达与LRRC8C在早期和晚期IPF均呈正相关，因此进一步沉默LRRC8C，探究其在CTD- 2528L19.6对成纤维细胞活化过程中的作用（图8）。

图8. CTD-2528L19.6在MRC-5细胞中调控LRRC8C

角度二：基于差异表达分析，预后分析，靶基因调控分析等传统生物信息学方法识别候选miRNA，并进一步基于细胞系水平和小鼠水平实验评估候选miRNA在抑制癌症进展方面的治疗潜力。

Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma

系统识别临床相关的miRNAs用于潜在的基于miRNA的肺腺癌治疗

（Mol Ther Nucleic Acids，8.8865）

该工作对TCGA的microRNA测序和RNA测序数据进行系统整合分析，以确定临床相关的肿瘤抑制microRNA。根据差异表达、生存显著性水平、与靶基因的相关性和对生存的累加效应，研究者最终确定三个候选miRNAs (miR-195- 5p、miR-101-3p和miR-338-5p)，并进一步基于实验评估这些miRNAs在抑制癌症进展方面的治疗潜力。实验结果表明，不仅单一miRNA模拟物的药物处理有利于抑制肿瘤生长，三种miRNA模拟物的联合使用更能有效抑制肿瘤生长和进展。

通过生物信息学方法识别候选miRNA（图1）：基于差异表达分析和预后分析对miRNA进行过滤，最终得到五个候选miRNA（miR-195-5p、miR-30a-5p、miR-30d-5p、miR-101-3p、和miR-338-5p）。并进一步确定这些候选miRNA调控的靶基因，发现有349个具有预后意义，且在正常-疾病中发生差异表达的基因与候选miRNAs表达高度相关。基于miRTarbase中miRNA-靶基因预测关系对这些靶基因进一步过滤，最终得到47个靶基因。候选miRNAs在miRNAs-靶基因相互作用网络中调控多个重要靶点，表明这些miRNAs在癌症发展中发挥关键作用。

图1. 通过生物信息学方法识别候选miRNAs

进一步对miRNA数量进行增加组合，并基于生存分析，探究miRNA在降低LUAD患者风险方面是否存在加成效应。结果表明，当纳入更多候选miRNA时，不同miRNA组合的HR值逐渐下降，表明不同miRNA之间存在累加效应。因此，研究者选择使HR达到最低的组合（miR-195-5p、miR-101-3p和miR-338-5p）作进一步分析，生存分析表明三个miRNA都高表达的患者比三个miRNA都低表达的患者预后更好，表明三个miRNAs共同高表达与LUAD患者预后较好有关（图2）。

图2. 候选miRNA的累加生存分析

体外实验验证3个肿瘤抑制相关候选miRNA：实验结果表明过表达miR-195-5p、miR-101-3p或miR-338-5p可降低A549、Bm7和Hop62细胞的生长和肿瘤进展水平（图3）。

图3：候选miRNA单独过表达可降低A549、Bm7和Hop62细胞的生长和肿瘤进展水平

联合过表达候选miRNA抑制小鼠体内肿瘤生长和转移：为证实候选miRNA的有效性，研究者进一步进行动物实验。由于miRNA组合的有效性大于任何单个miRNA，因此研究者在小鼠实验中进一步对三种miRNA组合进行评估。研究者将对照或三个miRNAs组合过表达的Bm7人肺癌细胞通过皮下注射到裸鼠体内，并监测产生的肿瘤的大小。结果表明，联合过表达候选miRNA抑制小鼠体内肿瘤的生长和转移（图4）。

图4. 联合过表达候选miRNA抑制小鼠体内肿瘤生长和转移

角度三：蛋白质组学+RNA测序基础结合生物信息学分析确定耐药相关蛋白质，药物抑制和蛋白靶向实验协同验证免疫调节药物耐药机制。

Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma

蛋白质组学分析揭示CDK6上调是多发性骨髓瘤来那度胺的靶向耐药机制

（NATURE COMMUNICATIONS，14.9196）

免疫调节药物(IMiDs)来那度胺和波马度胺是治疗多发性骨髓瘤的有效药物。然而，几乎所有患者最终都因获得性耐药而复发，但仅在小部分病例中发现耐药相关的基因改变。为确定耐药的非遗传机制，研究者对来自多发性骨髓瘤患者的5个配对治疗前和复发样本进行RNA测序以及磷酸化蛋白质组学分析。生物信息学分析揭示CDK6控制的蛋白质耐药特征，包括骨髓瘤高危因子如TRIP13和RRM1等。进一步实验证明在多种骨髓瘤细胞株中，CDK6的过表达降低对IMiDs的敏感性，而palbociclib抑制CDK6或蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)降解CDK6与IMiDs具有高度的体内外协同作用。该工作认为CDK6上调可以作为IMiDs耐药多发性骨髓瘤的药物靶点。

定量蛋白质组学分析识别复发性多发性骨髓瘤中失调蛋白质：生物信息学分析发现与治疗前相比，复发组有130个蛋白上调，228个蛋白下调。上调程度最高的蛋白包括TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和CDK6，而下调最多的包括UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。蛋白质免疫印迹分析进一步表明与原发样本相比，CDK6，TRIP13,，RRM1蛋白在复发样本中被更频繁的检测到。进一步实验表明短期使用来那度胺或蛋白酶体抑制剂72小时，对CDK6蛋白没有影响，甚至降低CDK6的蛋白水平，表明药物并没有直接诱导CDK6的表达上升从而导致耐药（图2）。

图1. 复发性多发骨髓瘤患者中CDK6蛋白上调

CDK6过表达增强IMiDs耐药：细胞系实验表明CDK6过表达会降低IMiDs的敏感性。

图2. CDK6过表达会降低IMiDs的敏感性

palbociclib抑制CDK6与IMiDs协同治疗多发性骨髓瘤细胞：Palbociclib在多发性骨髓瘤细胞株中没有中度活性。然而，palbociclib显著增强IMiDs的抗多发性骨髓瘤作用。在CDK6蛋白水平升高以及CDK6过表达细胞的获得性来那度胺耐药细胞中，palbociclib的加入恢复与亲代细胞相似的IMiDs敏感性水平，表明palbociclib治疗增加多发性骨髓瘤细胞对来那度胺的敏感性（图3）。

图3. palbociclib与IMiD协同治疗多发性骨髓瘤细胞

蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)降解CDK6与IMiDs具有高度的体内外协同作用（图4）：蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)降解CDK6与 palbociclib抑制CDK6具有相似作用。

图4. CDK6抑制与IKZF1/3降解协同作用

pomalidomide与palbociclib联合治疗多发性骨髓瘤的体外实验验证：小鼠实验结果表明pomalidomide与palbociclib联合治疗在体外同样有效，palbociclib抑制CDK6可以增强小鼠对pomalidomide的敏感性（图5）。

图5：pomalidomide与palbociclib联合治疗的体外实验验证

靶向骨髓瘤细胞中的CDK6可以逆转复发蛋白特征：细胞系实验表明在复发相关的细胞系中，复发相关蛋白的特征在CDK6被抑制后发生逆转，进一步推测CDK6抑制通过逆转复发相关蛋白表达特征恢复免疫治疗的敏感性。

图6：靶向骨髓瘤细胞中的CDK6可以逆转复发蛋白特征

小结：

相信看完今天的分享小伙伴们一定对生物信息在实验中的作用有了初步的理解和大概的掌握，最后就让我们来总结下生物信息在实验中的应用以及论证生物信息结论的经典实验吧！

生物信息在实验中的应用：

（1）确定研究对象：通过生物信息学分析锁定在疾病进展中发挥关键作用的因子，进而有助于课题的确定与开展。

（2）推动实验进程：在实验目的确定后，进一步基于生物信息学分析识别与目标基因、蛋白质等相关的调节因子，有助于机制分析和实验后续开展。

（3）补充完善实验结果：在实验完成的基础上，同样可以反推到组织，药效等公开数据中进一步完善实验结果。

论证生物信息结论的经典实验：

（1）锁定目标蛋白/mRNA/lncRNA后，分别通过抑制/过表达/药物靶向抑制等多个角度验证特征因子在疾病进展或其他药物响应中的作用。

（2）通过检测目标因子改变后，其他蛋白/mRNA/lncRNA等变化验证生物信息学的预测机制。

（3）在抑制/过表达的细胞系中，对特征因子进行重塑，恢复其功能后进一步验证特征因子功能。

好啦，今天的内容就是这些，希望咱们做生信的同学能和实验室的小伙伴们多多交流，互通有无，成为彼此的“骄傲”和“依靠”吧！你中有我，我中有你，还怕高分文章迟迟不来吗~

参考文献：

1. LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation

2. Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma

3. Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma