了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型，对了解癌症进展和免疫治疗机制至关重要 。今天小编给大家介绍一篇发表于《Communications Biology》(IF=6.331)杂志上的文章。该文章运用单细胞 RNA 测序 (SCRS) 和 T 细胞受体 (TCR) 测序来表征透明肾细胞癌(ccRCC) 的肿瘤免疫微环境。

摘要

透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的肾细胞癌类型，占所有肾癌的70%以上。ccRCC同时也是最具免疫特异性的肿瘤类型之一，尽管肿瘤的突变率较低，但免疫治疗时具有高应答率。为了表征 ccRCC 的肿瘤免疫微环境，研究者采用单细胞 RNA 测序 (SCRS) 和 T 细胞受体 (TCR) 测序来绘制3例ccRCC患者匹配的肿瘤和血液中 25,688 个 CD45⁺ 淋巴细胞和骨髓细胞的转录异质性。另外纳入4个个体的11367个来自肾脏和外周血的免疫细胞，以促进ccRCC特异性差异的识别和评估。与正常肾组织相比，肿瘤浸润免疫细胞中CD8⁺ T细胞和巨噬细胞数量总体增加。证明了肿瘤浸润性CD8⁺ T细胞的分化及转录状态，并确定了MKI67 ⁺增殖亚群是促进ccRCC进展的潜在元凶。研究人员利用SCRS的基因表达结果，通过亚群分配对临床结果和病理疾病进行优先预测。随着进一步的表征和功能验证，其结果可能揭示某些免疫细胞亚群可耐受治疗干预。

结果

1、ccRCC中免疫细胞单细胞表达谱绘制

研究者对来自ccRCC肿瘤的淋巴细胞和髓细胞以及三名未接受治疗的ccRCC患者的外周血进行了SCRS。其技术流程见图1。在这些样本中，研究者添加了来自正常人外周血和正常肾实质的免疫细胞，从而在37,055个原代免疫细胞中获得了22个簇的UMAP投影(图2a)。在三种组织中，簇0、1、3和7具有相似的基因表达(图2b)，外周血大部分富集于簇2，肿瘤组织在簇14、17、18和19中富集，正常肾脏在簇11中富集。基于基因表达，研究人员用三种方法将细胞谱系分配给每个簇：

(1)    T细胞(CD3E, CD8A、CD4和IL7R或CD127) 典型标记物的表达, B细胞(CD19和MS4A1),髓细胞(CD14和FCGR3A或CD16),和自然杀伤细胞(KLRD1和NKG7)(图2c)

(2)    通过ENCODE沉淀纯化的细胞群的基因特征的相关性(图2d)

(3)    基于TCR测序的T细胞克隆型分配。

基于这些方法研究人员通过注释单核细胞(簇0、5、11、12和16),CD4 ⁺ T细胞(簇4、6、10、13、15和20),CD8 ⁺ T细胞(簇1、8、9、17),NK细胞(簇3和7),B细胞(簇2),巨噬细胞(簇14),树突细胞(DC,簇18和19)，在正常肾脏或肿瘤中CD4⁺ T细胞和B细胞相对于外周血减少。然而有意思的是，在肿瘤中CD8⁺ T细胞和巨噬细胞相对于外周血增加(图2e)，这与预期结果相反。对配对的正常和肿瘤组织进行高通量免疫组化研究，发现与来自ccRCC患者样本的正常肾组织相比，肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的增加和CD4⁺ T细胞的减少具有相似的趋势（图3）

2.外周血与肿瘤CD8⁺淋巴细胞优先重叠

研究者研究ccRCC中CD4⁺和CD8⁺ T细胞克隆物种的动态变化，为TCRA和TCRB分配TCRR序列，并通过基因和核苷酸序列的组合来定义克隆型。主要在CD8⁺ T细胞群中观察到克隆型频率的增加（图4 a), 在所分配的NK3和NK7细胞簇中有扩增的克隆型，但是在其他T细胞簇中也观察到这些克隆型，表明T细胞的可能亚组与NK3或NK3基因表达重叠。在T细胞分类时，研究人员注意到在ccRCC患者中，CD8⁺ T细胞前10个克隆细胞与CD4⁺ T细胞所占的克隆型空间存在显著差异(图4b)。这种趋势在肿瘤浸润和外周血CD8⁺ T细胞之间保持一致。与CD4 ⁺ T细胞相比，CD8 ⁺ T细胞中共用克隆类型的相对患者特异性增加，且CD8⁺和CD4⁺ T细胞的患者克隆类型之间的重叠极小（图4 c)。根据CD8⁺克隆型患者特异性重叠显示，外周血克隆型相对较多(图4d)。有趣的发现是，三号病人肿瘤晚期(患者1和2的pT3a与T1相比)在肿瘤特异性克隆型中显示扩增，而在血液中未见(图4d)。在3个 ccRCC晚期患者中，两种克隆型共占619个CD8⁺ T细胞，分布在UMAP群中(图4e)，这支持T细胞克隆型既不是UMAP簇的决定因素，也不是功能指征的决定因素。这种与耗尽基因表达相关的克隆型分区可能反映了肿瘤本身的扩张起源。

3.CD8⁺ T细胞在ccRCC肿瘤中表现出不同人群的转录连续性

CD8⁺ T细胞的亚簇显示了八个不同的簇 (图5a)，且具有相对的组织特异性分布 (图5b)。组织浸润的CD8⁺ T细胞 (肿瘤和正常肾脏) 主要包括CD8_0，CD8_1，CD8_3，CD8_5，CD8_6和CD8_7，其中只有集群CD8_2和CD8_4的外周血细胞相对水平增加 (图5b)。研究人员检查了增殖基因特征的变异，发现具有与组织类型相似的分布，S或G2M期细胞从右到左增加，在簇CD8_6达到峰值 (图5c)。为了更好地描述CD8⁺簇，研究人员使用典型和差异的T细胞标记物来检测UMAP沿线的基因表达差异(图5d)。为了检查单个或选定基因的基因表达模式，研究人员使slingshot在子簇之间建立最小生成树，基于最多样化的基因生成曲线，除B1延伸至CD8_2外，其余曲线沿类似轨迹绘制，具有CD8_1的共同节点，并在不同簇上分支，肿瘤浸润CD8⁺T细胞水平增加(图5e)。在特定的克隆型序列中也观察到这种克隆型关系，在亚群CD8_0、CD8_6、CD8_5和CD8_3中可以看到重叠的克隆型（图5f）。相比之下，CD8_7与其他亚群的重叠克隆型最少（图5f）。基因集富集发现，簇CD8_0和CD8_5显示与终末端分化和衰竭增加相关。高度增殖的CD8_6群体代谢活动而丰富，如三羧酸循环和糖酵解，以及DNA修复（图5g）。研究与抗PD-1疗法的反应或无反应相关的特征的富集（图5h），使用序数在构建轨迹时，为细胞创建了一个伪时间变量，这有利于能够看到沿曲线的富集差异。

4.ccRCC中的CD4⁺ T细胞特征确定了不同的肿瘤内人群

CD4⁺ T细胞可以通过通过细胞溶解机制，也可以间接通过调节肿瘤免疫微环境来影响癌症的发病机制。CD4⁺T细胞亚群显示出9个不同的簇（图6a）其模式与组织分布的CD8⁺ T细胞相似，右侧主要为外周血CD4⁺ T细胞，左侧为组织浸润性CD4⁺T细胞（图6b）。与CD8⁺ T细胞一样，研究人员检查了UMAP沿线的典型和差异性T细胞标记（图6c）。在肿瘤浸润性CD4_4簇中，观察到Th1驱动因子TBX21（T-bet）、激活标记物LAG3和NR4A2的表达增加以及细胞因子的表达（图6c）。基于CD4 ⁺子簇构建单元轨迹曲线，可以看到CCR8 ⁺ SELL⁺ OSM6 ⁺簇CD4_1和CD4_3的两个根点，导致共同的CD4_4终止（图6d）。与其他CD4⁺ T细胞不同，Tregs产生的曲线是发散的，从CD4_6到CD4_7并进入CD4_4（图6d）。与其他肿瘤浸润的CD4⁺ T细胞相比，这可能代表了Tregs（由CD4_6和CD4_7共享）的独特表达模式。此外，与CD8⁺亚簇相比，CD4_4和CD4_5中出现适度的克隆扩张，且细胞轨迹不清晰(图6e)。在肿瘤浸润的CD4⁺T细胞中上调的是热休克蛋白（HSPA1A和HSPA1B）、Jun和FOS成分（FOS、JUN和JUNB）、MHC-II分子（HLA-DRB）和分泌因子（CCL5、GZMA和GZMK）。CD4_6集群增加了IL-6细胞因子、OSM6、AREG和SOCS3在白细胞介素信号传导下游的表达（图6f）。差异表达与通路分析紧密匹配，富含细胞溶解和I型干扰素信号传导的CD4_4。CD4_6和CD4_7 Treg簇优先富集代谢途径，在肿瘤浸润的CD4_5中具有高水平的终端分化。OSM^high CD4_6富集IL-6/JAK/STAT3信号转导和炎症反应基因(图6g)。

5.在ccRCC中，浸润性巨噬细胞明显具有转录分化。

在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中，亚聚类发现了 20 个不同的簇（图 7a）。 观察到组织特异性分布，大多数肿瘤浸润性骨髓细胞位于亚群 0、3、7、8 和 15 中（图 5b）。相反，正常肾实质和外周血均由大多数单核细胞亚群组成（图7b）。使用CD1C、CLEC10A（CD301）、FCER1A和MSR1等标记鉴定的巨噬细胞亚群（0、3、7、13和14）（图7c）。总的来说，与外周血相比，组织浸润性骨髓细胞中 CD14⁺ 单核细胞的比例降低，巨噬细胞增加。 正常肾实质的 CD14^-_、CD16^-单核细胞有不同程度的增加，但并不显着（图 7d）。接下来作者分离了五个巨噬细胞亚群，根据来自各自组织的细胞的相对百分比重新标记它们与肿瘤相关的巨噬细胞1 (TAM_1)，TAM_2，TAM_3，常驻巨噬细胞 (rM) 和外周巨噬细胞 (pM) (图7e)。尽管沿着保持整体表达结构的UMAP的分布相似，但这五个簇具有不同的表达模式 (图7e)。不同巨噬细胞亚群的表达具有差异性（图7f）。研究人员建立了基于不同基因的细胞轨迹，并发现两条不同的曲线会聚到TAM_3和pM中 (图7g)。为了评估巨噬细胞的潜在功能差异，进行了基因集富集分析 (图7h)。

6.CD8⁺ T 细胞和 TAM 亚群的不同预后意义

研究者证明了 ccRCC 中 CD8⁺ T 细胞和 TAM 的转录差异，为了验证这些转录差异是否导致肿瘤反应的功能差异，研究者试图从SCRS 数据中开发出具有预后价值的基因特征（图 8a）。通过训练结果为每种细胞类型选择最优模型。将模型应用于267个原发性肿瘤的测试队列，发现CD8_6和TAM_3这两个特征的总体存活率较高（图 8b）。同时还观察到不良预后预测与组织学分级增加有关（图8c）。在每个特征中，跨基因的组织学分级的表达没有明显的关联（图9）。然而，CD8_6 和 TAM_3 分类之间存在显着关联，在分类为良好预后和预后不良的患者中有高度重叠，但 CD8_6 签名更广泛地适用于区分 TCGA 数据集的总体存活率（图10）。研究者使用从四个健康组织样本中分离的T细胞质谱数据，在14.6%的CD45⁺ 、CD3⁺ 、CD8⁺ T细胞中发现了PD-1⁺ 、Ki-67^Hi亚群(图8d)。除PD-1外，与其他CD45⁺ 、CD3⁺ 、CD8⁺ T细胞相比，ccRCC中CD8⁺ T细胞增殖亚群的CTLA-4、ICOS、4-1BB (CD137)、TIM-3、HLA-DR和CD38水平升高(图8e)。通过计算样本中PD-1⁺  、Ki-67^Hi细胞占CD8⁺ T细胞总数的比例，发现PD-1⁺  、Ki-67^Hi细胞最高三分位的CD8_6基因签名分配具有类似的分布(图8f)。

总结

随着对免疫疗法工作原理的进一步了解，肿瘤微环境中免疫细胞的表型和功能特征影响预后和疾病结果。全面了解基因特征以充分了解特定免疫群体在癌症中的作用具有高度的病理相关性；不仅可以发现癌症进展的免疫失调决定因素，还可作为选择患者、评估免疫治疗获益可能性和进一步确定临床显著亚群的有用工具。尽管免疫治疗是晚期和未经治疗的ccRCC的主要治疗手段，但与其他免疫治疗反应性肿瘤相比，ccRCC肿瘤有许多违反直觉的免疫发现。这些截然不同的发现表明，ccRCC肿瘤的免疫区之间存在着更复杂的相互关系。