Cancers|肿瘤RBP预后分析方案
生信干货
zary ·2020年6月1日 02:50
神经胶质瘤，又称为胶质瘤或者胶质细胞瘤，是一种起源于神经上皮的颅内恶性肿瘤，根据恶性程度分为I-IV级，第IV级就是我们常说的胶质母细胞瘤(GBM)。研究表明，某些RNA结合蛋白(RBPs)的表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关。RBPs通过结合靶RNAs，在转录后水平调节基因表达。RBPs参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等。小编今天带大家看的这篇文章是四月份发表在cancers杂志(IF=6.16)上的，作者利用加权共表达网络分析(WGCNA)构建了RBPs表达与GBM患者临床特征之间的关联。
Integrated Analysis of RNA-Binding Proteins in Glioma研究中使用的人类RBPs整理自以下6个数据库：Gerstberger, SONAR, the Gene Ontology project, Poly(A)-binding protein, CARIC和XRNAX；下载的数据集有TCGA数据库中699名患者的转录组数据，以及CGGA中包含325个样本的RNA-seq数据(ID是mRNAseq_325)；在生存分析时，用到了138名GBM患者的临床信息，其中54名为复发性和继发性；此外，CGGA中205个新样本的生存和临床数据被用来验证研究结果。作者根据RBPs的结构域是否得到证实将它们分为标准(canonical)RBPs和非标准(non-canonical)RBPs两组，结构域信息来源是Pfam数据库；用DAVID做了GO和KEGG的富集分析以及可视化等分析。作者从TCGA获得了包含3564个RBPs的表达谱，然后用R包WGCNA构建了一个共表达网络。首先，基于RBPs表达谱，将胶质瘤样本按照不同的临床特征进行层次聚类；然后，根据RBPs间的皮尔森相关系数筛选软阈值β，来确保网络的无标度性，这里β为6；根据TOM这一相似性量度，研究通过AL层次聚类法(组间距离等于两组对象之间的平均距离)将表达相似的RBPs聚到了同一模块。接下来，文中定义了两个参数MEs和GS， MEs代表第一个主成分相关的模块，它的值代表模块中的所有基因，GS表示基因和临床性状之间的相关性，用于量化单个基因与感兴趣的性状的关联关系。单因素COX回归分析用来评估RBPs的预后价值，并筛选出与生存时间相关的RBPs作为基因特征对TCGA和CGGA数据集进行风险分类。然后，通过多元Cox比例风险回归分析构建了风险特征，计算了每个患者的风险评分，最后根据中值将患者分成高低风险组。该研究从ATCC购买了人类GBM细胞系LN229和U251，然后培养、切片、转染等。此外，作者还做了siRNA转染、细胞增殖、qPCR和Western Blot分析，以及RNA免疫沉淀和高通量测序。作者评估了大约3564个RBPs的表达水平。归一化后，用和作为单个患者中RBPs和TFs的表达丰度。DEGs使用R包DEseq2筛选的，绘制箱式图和对表达差异的统计分析用了R包ggplot2、ggpubr和ggsignif。单变量和多变量Cox比例风险回归分析用的都是survival包。生存曲线采用的是Kaplan-Meier法。RNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因表达，转录因子(TFs)则在转录水平进行调控。作者对比了二者在几个数据集的丰度，发现RBPs显著高于TFs(图1.C-D)。在3564个RBPs中，差异表达的约43.13%，在1725个TFs中，差异表达的有34.02%，这些数据表明RBPs可能在胶质瘤中起着更重要的作用。
文中根据WHO的分类标准，将TCGA的胶质瘤患者分成了14类，CGGA患者分成了12类(图2.A-B)，然后通过分析RBPs的mRNA表达水平，发现RBPs的丰度随疾病程度的加深而增加。作者又基于患者的RNA测序数据分析了RBPs的表达水平，结果表明具有IDH(这个基因在胶质瘤中突变频率很高)突变的患者，其RBPs表达水平低于野生型。接下来，他们比较了TCGA和CGGA数据集中不同分子亚型的RBPs表达水平，与图2.C中其他三种亚型相比，RBPs在neural亚型中的表达显著下调，并且与疾病等级无关。
图3.A和B分别列出了部分候选的标准和非标准RBDs(RNA结合结构域)，在3564个胶质瘤相关的RBPs中，只有965个包含标准RBDs。GO富集结果显示，标准RBPs富集到了转录、翻译、RNA剪接和加工以及线粒体翻译相关的生物过程；而非标准RBPs的富集除了跟标准RBPs有部分重叠外，还在蛋白质修饰、稳定、定位和代谢等生物学过程有富集，KEGG的富集结果与之基本一致。
作者使用R包WGCNA 将TCGA中包含3564个RBPs的表达数据转换成了基因共表达网络。首先，从TCGA胶质母细胞瘤数据集中选择了160例不同年龄、性别和总生存率的患者进行RBPs表达聚类(图4.A)；然后，参数β=6，通过一步邻居网络构建方法获得了10个共表达模块(图4.B)；接下来，对不同的共表达模块跟样本性状做了相关性分析，如图4.C所示，黑色模块与年龄显著相关，绿色模块则跟患者的总生存期关联最密切，因此，研究进一步分析了绿色模块和胶质瘤患者预后的关系。
作者通过Cox回归分析，在绿色模块中识别了8个预后相关的RBPs(图5.A)，它们的风险比(HR)都大于1。然后，文章使用多元Cox比例风险回归模型将这8个RBPs构成了一个基因特征，根据中值风险评分，TCGA和CGGA中的患者都被均分到了高、低两个风险组。生存分析的结果也表明，风险得分高的患者生存时间短(图5.D)。这个基因特征的ROC曲线也展现了它们较好的预测生存期的性能。最后，作者还发现这些 RBPs的mRNA表达水平在高风险组有所增加(图5.F,G)，由此认为它们的高表达会影响GBM预后。
在上文提到的8个预后相关RBPs中，有3个是非标准的，5个标准的。作者设计siRNAs降低了它们在胶质瘤细胞中的表达，来查看它们的生物学功能。在细胞系LN229中，敲除PTRF或FNDC3B这两个非标准RBPs，会显著抑制细胞增殖， LRRFIP1，ZC3H12A和HSP90B1这三个RBPs的沉默同样会抑制增殖(图6.B)。此外，作者注意到PTRF参与了GBM增殖的维持，在另一个胶质瘤细胞系U251中敲除PTRF后，细胞增殖也受到了抑制，敲除FNDC3B得到了同样的结果。
基于以上的分析结果，作者在LN229细胞中对PTRF这一非标准RBP做了RIP实验，RIP就是RNA结合蛋白免疫沉淀，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。然后通过高通量测序，识别了PTRF特异性靶基因，并获得了胶质瘤生物学相关的靶RNAs，大多数靶RNAs参与了胶质瘤的增殖(图7B)。对PTRF靶基因的GO富集发现它们显著富集到了转录、蛋白质泛素化和凋亡等过程，以及细胞衰老和细胞代谢等通路(图7C,D)。
好了，今天的文章小编就为您解读到这了，have a nice day!
