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今天给大家分享一篇2021年1月5日发表在Cancers（IF:6.126）的一篇文章，文章的题目为“Immunogenomic Gene Signature of Cell-Death Associated Genes with Prognostic Implications in Lung Cancer”。该文章主要研究了细胞死亡相关基因与肺腺癌（LUAD）患者预后的相关性。研究显示研究者构建的细胞死亡指数（CDI）可以显著区分肺癌患者的生存率，可用于肺癌患者的预后预测。
研究背景
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。肺癌主要分为两个亚型：小肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。非小细胞肺癌占所有肺癌病例的大多数（约85%），包括两种主要类型。在NSCLC中，肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）分别占总病例的70%和30%。FDA已经批准了针对PD-1/PD-L1信号通路的免疫检查点抑制剂作为治疗方法。尽管免疫疗法已经开始发展成为一种有吸引力的方法，但目前缺乏对这些免疫疗法有反应的患者的预后和预测性鉴定。此外，由于患者的变异性，并非所有患者都能观察到这些免疫疗法的益处。因此，需要新的生物标志物或危险分层方法来帮助LUAD患者的临床治疗。
人体由数万亿个细胞组成，每天有几百万个细胞死亡。这些决定细胞在人体内命运的自然过程可以广义地定义为程序性细胞死亡（凋亡和自噬）和非程序性被动细胞死亡（坏死）。细胞死亡途径，如自噬，凋亡和坏死，可以提供有用的临床和免疫学的见解，可以帮助设计个性化的治疗。
在这项研究中，研究者发现了21个差异化的细胞死亡相关基因，它们显著区分肺癌患者的生存率。这些新的基因特征的发现可以用于肺癌患者的预后预测，也可以为患者的治疗定制个性化的新免疫疗法。
研究路线
研究结果
1、用细胞死亡指数（CDI）分析患者的生存率
试验方法和结果：1）为了确定肺腺癌细胞死亡基因的预后关联，通过基因集富集分析（GSEA）网站访问KEGG和GO数据库，下载自噬（n=34个基因）、凋亡（n=86个基因）和坏死（n=49个基因）的KEGG数据集。在自噬基因中，ATG12、GABARAPL1、IFNA17、IFNA8与生存率相关。在凋亡基因中，BCL2L1、CASP9、CHP2、CYCS、EXOG、IL1A、IL1R1、IL1RAP、IL3RA、NFKBIA、PIK3CA、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PRKAR1B、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10D、TNFRSF1A显示与生存相关。对于坏死，DNML1、GSDME、IPMK、MLKL、RBCK1、TICAM1、YBX3显示与生存相关。BAX、BIRC3、FADD和FAS在凋亡和坏死之间重叠。
2）为了确定单个细胞死亡途径的多基因预后特征，研究者尝试了不同的基因组合，综合来看，5个自噬基因、9个凋亡基因和7个坏死基因与肺癌的预后相关（表1）。
3）将显示这些基因特征最高和最低表达的患者的z评分分为两组，并比较自噬（0.75和0.75），细胞凋亡（1.51）和−0.50），坏死（0.97和−0.59）中位数z评分的差异（图1a）。
4）选择≥2个细胞死亡途径的患者，并根据基因表达CDI进行分组（图1b）。
2、患者RNA序列分析
试验方法：TCGA-LUAD RNA序列的RNA序列数据，V2 n=510名患者，从国家癌症研究所门户网站下载(https://gdc.cancer.gov/). DESeq2软件包用于分析高CDI组和低CDI组的差异表达基因。
试验结果：共有943个差异表达基因，与低风险组相比，高风险组中有329个基因上调>2倍。与高风险组相比，低风险组共有614个基因上调>2倍。主成分分析（PCA）显示基于CDI的高风险组和低风险组之间存在明显的分离（图2a）。图2b描绘了高风险和低风险患者之间差异表达基因的火山图。
3、临床病理及生存分析
试验方法：1）从TCGA下载肺癌患者的临床病理特征(https://gdc.cancer.gov/). 数值在中位数处分开，并在高风险组和低风险组之间进行比较。单变量和多变量Cox比例风险模型用于分析临床病理变量（CDI、肿瘤分期、淋巴结、远处转移、年龄、性别和放疗）。95%置信区间（CI）的危险比（HR）以总生存率（OS）为基础。
2）从510例患者中，选择59例细胞死亡基因表达最高的患者（CDI高组）和49例细胞死亡基因表达最低的患者（CDI低组）进行分析。进行了Kaplan–Meier生存分析，以比较两个队列的总体生存（OS），无病生存（DFS），疾病特异性生存（DSS）和无进展生存（PFS）数据。
试验结果：1）高风险组和低风险组的临床参数、分期、淋巴结受累、非整倍体评分、生存状态（OS、PFS、DFS、DSS）存在显著差异（表2a）。
2）在单变量Cox比例风险分析中，高危组与较差的生存率相关。与较差生存率相关的其他重要变量为Ⅲ+Ⅳ 期组患者、肿瘤扩散至淋巴结（N1+N2+N3）的患者、远处转移的患者和接受放射治疗的患者。在多变量Cox比例风险中，只有三个变量与较差的生存率相关：高CDI、III+IV期患者和淋巴结扩散（N1+N2+N3）患者。
3）采用Kaplan–Meier分析，根据CDI将高危组患者与低危组患者区分开来。观察到的两个风险组的总生存期差异分别为40.41和76.21个月（图3a）。DFS分别为62.23和158.20个月（图3b），对于DSS，49.28高危组为49.28个月，低CDI患者未达到生存月阈值（图3c），两个风险组的PFS分别为26.24和48.69个月（图3d）。
4、细胞因子基因表达分析
试验方法：1）为了评估患者的免疫活性，从cBioportal下载不同细胞因子的z评分。使用关键字“KEGG细胞因子-细胞因子-受体相互作用”下载细胞因子基因信息（n=265个基因）(https://www.gsea-msigdb.org)。
2）使用String-db门户进行功能丰富分析(https://string-db.org/).
试验结果：1）在自噬组中，发现高风险组中BMPR1A、KIT、TGFBR1和IFNGRI的表达较高，而低风险组中CX3CL1和TNFSF11的表达较高（图4a）。对凋亡和坏死组进行了类似的分析（图4b，c）。在CDI组中，发现高危组患者的IL15RA、IL-15、IL-7、IL4R、IL-18、FAS、TNFSF13B、TNFSRF1A、CXCL10等表达较高，而低危组患者的LIFR、IL6R、EPOR、KITLG、ACVR2B和IL11RA表达较高（图4d）。
2）功能富集分析显示高CDI组炎症细胞因子的比例较高（图4e，f）。
5、免疫细胞分析
试验方法：采用微环境细胞群（MCP）计数法，利用肿瘤免疫评估资源门户（TIMER）对免疫细胞浸润进行定量研究(http://timer.cistrome.org/)。在这项研究中，将高CDI和低CDI患者的标准化RNA-Seq值用作使用TIMER门户的MCP-counter算法输入。
试验结果：1）MCP计数器算法证明，T细胞和CD8+ T细胞浸润增多与高凋亡、坏死和高细胞死亡指数患者组相关（图5a，b）。在坏死程度高的患者中，NK细胞浸润程度较高（图5c）。B细胞浸润在任何一组中均未显示任何显著性（图5d）。巨噬细胞在高凋亡、坏死和高CDI组表现出更高的浸润（图5e）。髓样树突状细胞仅在高自噬组浸润明显增加（图5f）。
2）除自噬组外，所有组的中性粒细胞均有较高的浸润（图5g）。除自噬组的内皮细胞外，其他高细胞死亡组的内皮细胞和癌相关成纤维细胞的出现率较高（图5h，i）。这些差异显示在不同细胞死亡组的淋巴细胞和其他细胞的热图中（图5 j，k）。
6、免疫抑制与T细胞衰竭标志物分析
试验结果：研究者发现高凋亡、坏死和CDI组中CD274和CTLA4的表达更高（图6a，b）。T细胞衰竭标记基因（HAVCR2、TIGIT、LAG3、PDCD1、CXCL13、LAYN）在高自噬、凋亡、坏死和CDI组中表现出较高的表达（图6c）。所有中位数的热图反映了高危组中T细胞衰竭基因的高表达（图6d）。
7、功能富集分析
试验方法：利用g:Profiler程序进行基因水平功能富集(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler)。根据统计意义定量地将基因定量映射到相应的富集途径。
试验结果：1）高CDI组和低CDI组间差异基因表达的功能富集分析显示943个基因，其中，高危组有329个基因上调，而低危组有614个基因上调（图7a，b）。
2）低CDI组有明显的免疫相关通路，而高CDI组缺乏丰富的免疫通路。低CDI组的富集基因本体论术语为受体配体活性、信号传导、细胞因子和趋化因子活性（图8a，b）。高CDI组中的富集基因本体论术语主要是跨膜转运蛋白和门控通道活性（图8c，d）。
文章总结
肺癌是全世界死亡的主要原因之一。细胞死亡途径，如自噬，凋亡和坏死，可以提供有用的临床和免疫学的见解，可以帮助设计个性化的治疗。在这项研究中， 研究者分析与自噬（n=34个基因）、凋亡（n=66个基因）和坏死（n=32个基因）相关的基因，以评估肺癌的预后意义。利用这些重要基因建立了21个基因的细胞死亡指数（CDI），对患者进行各项分析。分析结果显示CDI显著区分肺癌患者的生存率。这些新的基因特征的发现可以用于肺癌患者的预后预测，也可以为患者的治疗定制个性化的新免疫疗法。
