各位小伙伴，大家好呀！ 今天给大家带来的是一篇根据单核和空间转录组分析确定了胰腺癌中与新辅助治疗相关的多细胞动态变化的一篇文章，在这项研究中，研究者使用单核RNA测序和全转录组数字空间分析(DSP) 对PDAC肿瘤标本构建了组成PDAC的细胞亚型和空间群落的高分辨率分子景观，同时发现了恶性细胞和成纤维细胞中一个新发现的神经样恶性细胞祖细胞程序，在化疗和放疗后富集，并且与不良预后相关。进一步基于恶性细胞、成纤维细胞和免疫细胞对接受新辅助治疗的胰腺导管腺癌患者进行重新划分，经过完善的细胞分类学可以为临床PDAC患者的分层提供框架，提供新的精准靶向治疗方案。快来和小编一起看看吧~

研究背景

胰腺导管腺癌越来越多地采用新辅助化疗或放射治疗的形式，但在很大程度上来说都是一种难以治疗的疾病。肿瘤微环境影响细胞毒性的治疗效果，但是促进了辅助治疗的效果，但是对于肿瘤微环境的空间结构和多细胞相互作用的了解仍然有限，单核RNA测序(snRNA-seq)可以很好地分析恶性细胞和基质细胞，并可以对冷冻样本进行测序，作者在本研究中对43个肿瘤患者（18个未治疗和25个治疗）共224988个细胞进行snRNA-seq，发现在治疗后残留的肿瘤衍生的类器官中富集一种独特的神经样祖细胞(NRP)恶性程序；同时与全转录组空间图谱相结合确定了几个不同的多细胞群落，其中包括一个表征了NRP恶性程序和CD8⁺T细胞的治疗富集的细胞亚型。此外，作者发现细胞间受体配体相互作用在治疗后残留肿瘤中富集存在，并作为改进胰腺癌新辅助治疗的潜在靶点。

结果一：对冷冻人类PDAC肿瘤样本进行snRNA-seq分析

作者在本研究中对43个肿瘤患者（18个未治疗和25个治疗）共224988个细胞进行snRNA-seq（图1A），在25个接受治疗的患者中，14名患者接受FOLFIRINOX多周期化疗和多段放疗（氟尿嘧啶/卡培他滨CRT)； 5名患者被纳入一项临床试验(NCT01821729)，研究新辅助CRT加用氯沙坦(CRTL)。另外6例患者接受其他形式的新辅助治疗。对数据进行无监督聚类后共分为33个亚群，利用Marker基因进行细胞注释后得到12种细胞类型。其他细胞类型包括恶性上皮细胞、非恶性上皮细胞、免疫细胞、内分泌细胞和各种基质细胞（胰腺内神经元细胞、内皮细胞、成纤维细胞等）（图1B-C）。恶性细胞和非恶性细胞由CNA判定。同时作者发现一小部分腺泡细胞(reg +)表达高水平的再生家族成员基因(如REG1A和REG3A)，这些基因与促进胰腺炎症、腺泡-导管上皮生(ADM)和胰腺上皮内瘤变(PanIN)(图1d)有关。snRNA-seq捕获的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞类型比例的代表性分布与多路离子束成像(MIBI)在单个肿瘤内部和肿瘤之间相比，异质性相差较大(图1f)。最后，作者进一步说明了新辅助治疗相对于CRT患者的免疫功能更强。在5例患者的临床亚组(未治疗、CRT和CRTL)中，接受新辅助治疗的肿瘤恶性细胞比例明显较低(图1g)，与组织学的情况一致。几个非恶性细胞亚群在治疗组之间存在显著差异(图1g)。例如，在免疫部分，新辅助CRTL中CD8+ T细胞的比例高于CRT，并且其中的CD8+ T细胞表达更高水平的效应功能基因(如IL2、CCL4和CCL5)。这些结果与氯沙坦介导的瘤内细胞毒性T细胞活性增加一致。

图1：未治疗和治疗的PDAC的snRNA注释出的细胞类型多样性。

结果二： ADM和非典型导管细胞。

在上皮腔室中，有低cna共表达导管和腺泡谱系的标记物(图1b,d和2c,d)，可能反映ADM, ADM在小鼠胰腺肿瘤的发生中起启动作用。慢性炎症和激活KRAS突变与ADM状态的持续和进展到PanIN相关。与腺泡细胞相比，ADM细胞中HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP里面的signature的表达更高(图2a)。此外，导管细胞的一个细胞亚群表达了高水平的导管(如CFTR)和恶性(如KRT5和KRT19)标记物，但没有升高的CNAs，因此在这篇文章里面该亚群被定义为非典型导管细胞(图1b,d和2c,d)。接下来，作者根据该非典型导管细胞亚群进一步进行基因集的分析，发现该非典型导管细胞亚群具有早在PanIN2/3期就表达的基因(如KRT17)，并且相对于ADM细胞来说其具有更高水平的HALLMARK_KRAS_ SIGNALING_UP信号，因此这里作者提出可将该细胞亚群作为ADM进展到PanINs的一个中间过程(图1b,d和2c,d)。最后，作者进行伪时序分析，推断出从腺泡细胞到ADM到导管细胞到非典型导管细胞到恶性细胞的主要伪时间轨迹，并且与此同时作者发现HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP信号通路特征平行于上述细胞轨迹并且单调增加，因此该结论更加支持了ADM和非典型导管细胞可以作为PDAC肿瘤发生的相关中间状态(图2a,b)。

图2：通过轨迹分析推断上皮细胞类型组成腺泡导管化生和非典型导管中间产物

结果三：恶性和成纤维细胞程序共享的肿瘤

尽管大多数肿瘤以基底样/鳞状/间充质和经典亚型的恶性细胞为特征(扩展数据图4a)，但这些状态可能在一些恶性细胞群中发生同时出现或部分缺失的情况。此外，肌成纤维细胞和炎症signature在一些不同的CAFs亚群中表达，但抗原递呈标记未被明确识别，因此作者在这里利用共识性非负矩阵分解(cNMF)方法，在不同肿瘤的恶性细胞和CAFs中重新学习了细胞类型的复发表达模式。作者重点关注来自多个患者的跨细胞共享的cNMF程序(图3a、b)，识别出了14种恶性细胞程序和4种成纤维细胞程序。除了先前报道的亚型，作者还识别到了三种细胞亚型，分别为离散的鳞状、基底样和间充质细胞；并进一步对高CAN的恶性细胞亚群进行分析，确定了腺泡样程序和神经内分泌样程序。然而在之前的研究中，大量研究通常将内分泌样或外分泌样特征归因于肿瘤亚群不纯的非恶性细胞，但作者的数据表明这些特征存在于恶性细胞中。因此，小编认为这是本文的一个亮点，这里揭示了一个支持异常分化的内分泌和外分泌（ADEX）亚型，并通过原位验证揭示了一个独特的NRP程序。

接着作者将单细胞测序分析出的基底样、鳞状和间充质程序与之前通过bulk定义的基底样、鳞状和准间充质程序进行富集分析；鳞状细胞程序和基底样细胞程序与Moffitt基底样信号显著重叠，但鳞状细胞和间充质程序分别与bulk定义的鳞状细胞和准间充质亚型没有显着重叠（图3c）。

最后作者对新发现的独特的NRP程序进行功能分析：发现的NRP程序可以同时丰富了神经发育/迁移/粘附等通路基因。并且相对于的研究，作者将NRP和神经内分泌样程序二者进行了很好的区分（图3b、d）。此外，NRP程序还与人类蛋白质图谱中的“脑组织增强”基因显著富集，最后作者通过多重免疫荧光原位验证了该程序，并显示一部分恶性细胞/腺体共同表达细胞角蛋白和NRXN3，NRXN1（典型表达于大脑皮层和尾状核的神经元和胶质细胞的程序基因）（图3e、f），揭示了一个富含与神经系统和神经周围侵袭（PNI）相关的基因的NRP程序。

图3：PDAC中恶性细胞的分子分层揭示了一种NRP程序

结果四：CAF分类确定了四个程序

对四个CAF程序进行分析，发现富含ACTA2的肌纤维母细胞祖细胞程序与之前研究结果中已发表的myCAF信号重叠（图4a、b），同时进行signature以及其他功能分析反映了不同的iCAF子集的异质性（图4b）。

图4：PDAC中CAF的分子分层

结果五：治疗相关恶性肿瘤和CAF程序表达

作者发现，新辅助治疗中恶性和CAF程序在不同患者中具有显著异质性。与未治疗组相比，恶性NRP和神经内分泌样程序在CRT组明显更高，经典和鳞状程序较低；同样，新辅助CRTL相比于未治疗组也显示出更高的NRP程序表达，而经典的鳞状和基底样程序的表达较低（图5A、B）；之后作者通过培养类器官进行实验验证，证实了与未治疗相比，被治疗过的患者类器官细胞系中NRP程序增加（图5C）。

最后作者将分析结果与临床相关联，证明了治疗后程序表达也与临床反应相关。在这里根据患者的外科病理治疗反应等级对25个治疗样本进行注释，对七个恶性谱系剩余恶性细胞进行评分。与未治疗的肿瘤相比，NRP方案中残留的恶性细胞增加(图5D)；为了评估恶性和CAF的预后相关性，研究者收集来自TCGA和PanCuRx/ICGC9的未治疗的原发性PDAC患者的bulk RNA数据，对疾病进展时间（TTP）和总生存期（OS）进行了多变量Cox回归分析，发现NRP和鳞状细胞程序与较短的TTP相关，而经典和免疫调节程序与较长的TTP有关(图5E)。

图5：NRP在经细胞毒性治疗后残留的肿瘤患者衍生的类器官部分显著富集，与不良临床结果相关

结果六：将细胞类型程序映射到肿瘤结构（与空转结合）

作者捕获和分析感兴趣区域(ROI)的mRNA计数(图6A)，在这里作者使用四色免疫荧光法选择具有不同肿瘤细胞、CAFs和免疫细胞模式的ROI;为ROI内的每个细胞类型段创建自定义照明区域(AOIs);从每个AOI中切割并收集条形码并量化条码丰度。用DSP分析了21个肿瘤，并用snRNA-seq细胞类型特征对数据进行反卷积。观测得到上皮、CAF和免疫AOIs按细胞类型聚集。然后作者将每个恶性和CAF程序的表达映射到ROI上，结果显示NRP和神经内分泌样恶性程序更加富集于CRT的ROI中，与snRNA分析一致。

图6：恶性肿瘤和CAF程序的空间映射揭示了程序特异性与肿瘤内和肿瘤间异质性的关系

为了识别多细胞空间关联，研究者将ROI中的每对特征关联起来，以产生恶性谱系程序、CAF程序、免疫细胞类型的比例以及恶性、成纤维细胞和免疫细胞ROI面积的空间协变矩阵。最后作者通过无监督聚类确定了三个具有不同恶性、基质和免疫特征的多细胞亚群。对单个多细胞亚型进行功能分析发现，治疗富集亚型1的特点是其内部NRP与神经内分泌样恶性程序、嗜神经性CAF程序和CD8+T细胞之间的关联，同时富集间充质和腺泡恶性程序和免疫调节CAF程序。鳞状细胞-基底细胞样亚型2的特点是鳞状细胞样和基底细胞样恶性程序与多种淋巴和骨髓细胞类型、较高的上皮细胞和免疫含量以及较低的CAF含量相关。经典细胞样亚型3表现出经典恶性程序、更高的CAF和更低的免疫比例。snRNA-seq数据中患者级别特征的聚类概括了其中一些关联。

图7：恶性肿瘤程序、CAF程序和免疫细胞组成的空间分析揭示了三种不同的多细胞群落和治疗相关的受体-配体相互作用

自此这篇文章的主题内容就介绍完毕啦，总的来讲，这项研究利用了胰腺导管腺癌患者肿瘤组织样本进行单细胞核以及空间转录组分析，探究了新辅助治疗下相对于放疗和未治疗患者改变的分子机制。一系列结果表明，新辅助治疗的效果与本研究新识别到的恶性细胞亚程序和成纤维亚程序显著相关。这项工作桥面的结合单细胞多组学数据以及空间转录组，对胰腺导管腺癌新辅助治疗患者提出了精准的分子分型，对未来临床设计新的新辅助治疗方案具有重要参考价值。