2021年6月29日，一篇题为“m5C-Related lncRNAs Predict Overall Survival of Patients and Regulate the Tumor Immune Microenvironment in Lung Adenocarcinoma”的文章发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF:6.684）上。文章创新性的研究了RNA甲基化的另一种常见形式——5-甲基胞嘧啶（m5C）对肺腺癌预后的影响，为科研工作者研究m5C对癌症的预后提供了借鉴思路。

研究背景

        甲基化是常见的 RNA 转录后修饰方法，5-甲基胞嘧啶（m5C）是常见的 RNA 甲基化修饰方法之一。据报道，m5C 基因座参与了多种生物过程，包括 RNA 的结构稳定性和代谢、tRNA 识别和应激反应。此外，m5C 修饰也与癌症进展密切相关。

        长链非编码 RNA（lncRNA）是主要的非编码 RNA，是长度超过 200 nt 的转录本。已知它们在染色质重塑、转录和转录后调控中发挥关键作用。此外，lncRNA 的 RNA 甲基化已被证明会影响癌症进展。然而，关于lncRNAs中m5C调控的研究还很少，需要进一步研究。

        本研究利用来自癌症基因组图谱（TCGA）数据集的 LUAD 中 m5C 相关 lncRNA 的表达数据，筛选出 14 个具有预后价值的 m5C 相关 lncRNA，构建了 m5C 相关 lncRNA 预后模型（m5C-LPS），并进一步分析了m5C-LPS与免疫细胞浸润亚型的关系。探讨肺腺癌（LUAD）中m5C相关lncRNA的RNA甲基化的不同基因特征、预后价值以及对肿瘤免疫微环境（TIM）的影响，以期为LUAD的治疗提供指导。

研究结果

1、LUAD与正常肺组织m5C调节因子的差异表达

研究方法与结果：1）为了鉴定LUAD中m5C调控因子的差异表达基因和相关功能，使用TCGA数据库分别分析了497例LUAD和54例正常肺组织。研究者发现m5C 调节因子的表达在 LUAD 和邻近正常组织之间存在显着差异（图 1A）。

2）使用STRING数据库构建了14个m5C相关lncRNA的PPI网络（图1B）。

① TRDMT1 是该网络的核心基因，被发现与其他 4 个基因相互作用。然而，当我们进行相关分析时，TRDMT1 并未显示出与其他基因的强相关性（图1C）。

② NSUN4、NSUN7、NSUN6、DNMT3B、DNMT3A 和 DNMT1 与其他基因具有弱到中等的相关性，而 NSUN3 和 TET2 的相关性最强（图 1D）。

研究结论：以上结果表明LUAD中m5C调节因子之间存在一定的相互作用。

2、鉴定具有重要预后价值的 m5C 相关 lncRNA

研究方法与结果：1）从 TCGA 数据库中，结合 LUAD 生存数据确定了 1094 个 m5C 相关的 lncRNA，并进行了单变量 Cox 回归分析以确定具有重要预后价值的 m5C 相关的 lncRNA。研究结果揭示了 53 个与癌症风险相关的 m5C 相关 lncRNA。其中，46 个 m5C 相关 lncRNA 被证明是保护因素，而其中 7 个是高危因素。使用多变量 Cox 回归进一步分析，在 53 个 m5C 相关的 lncRNA 中，14 个 m5C 相关的 lncRNA 被揭示具有预后价值（表 1）。

2）研究者构建了一个共表达网络，用于可视化 LUAD 中 14 个 m5C 相关的 lncRNAs-mRNA。研究者发现与 TET2 （n = 11） 共表达的 lncRNA 数量最多，其次是 NSUN7 （n = 8） 和 NSUN3 （n = 7）。与 SH3BP5-AS1 共表达的 mRNA 数量最多（n = 6），共表达的 lncRNA 是主要的保护因素（图 2A、B）。

3）使用 GEPIA 在线数据库分析共表达网络中相关基因的表达强度发现 m5C 相关的 lncRNA 和 m5C 基因之间存在弱相关性，其中 TRDMT1 和 LINC00578 之间的相关性最强，其次是 ALYREF 和 TMPO-AS1，m5C 相关 mRNA 的表达与 lncRNA 的表达呈正相关（图 2C）。

4）根据获得的风险评分公式和中位风险值将 1344 名 LUAD 患者分为高风险组和低风险组。

① Kaplan-Meier 生存分析显示，高危组的 OS 比低危组差（图 3A），表明风险评分具有预后价值。

② 风险曲线和散点图说明 LUAD 患者的风险评分与相应生存状态之间的关系（图 3B），风险评分越高，死亡率越高。

研究结论：确定了具有重要预后价值的 m5C 相关 lncRNA，并基于 14 个 m5C 相关 lncRNA 建立了 m5C-LPS 预后模型。

3、m5C相关lncRNA差异表达与临床病理变量的相关性

研究方法与结果：1）研究者对 14个m5C 相关的 lncRNA 进行了单变量分析，并根据单个基因的表达将患者分为高表达组和低表达组。其中，ABALON、AL034397.3、NKILA、TMPO-AS1高表达组患者的OS低于低表达组。相比之下，AC005911.1、AC090948.1、AC106047.1、AC124045.1、AL513550.1、HLA-DQB1-AS1、LINC00654、AL035701.1、SH035701.573BP3高表达组患者的OS高于低表达组（图 4A）。

2）m5C-LPS高危组和低危组的病理分期、T分期和生存状态存在显着差异。然而，没有发现性别、年龄、N 期和 M 期有任何显着差异（图 4B）。

3）对 m5C 相关 lncRNA 与临床病理特征之间的相关性进行了深入分析，发现在 T 阶段，5 个 lncRNA 在组间表现出显着差异。同样，发现 7 个 lncRNA 在 N 阶段的不同组之间显示出显着差异。关于 M 和 S 阶段，分别鉴定了 2 和 6 个 lncRNA，不同组之间存在显着差异。有趣的是，研究者检测到 AL034397.3 的表达在所有（T、N、M 和 S）阶段的各组中有所不同，表明这可能是核心预后基因（图 4C）。

4、m5C-LPS预后模型的验证和列线图的构建

研究方法与结果：1）使用单变量和多变量 Cox 回归分析来确定 m5C-LPS 是否可以用作独立的预后因素。在单变量 Cox 回归分析中， HR = 1.157，而在多变量 Cox 回归分析中，HR = 1.282。表明风险评分作为重要的预后因素可能与年龄、性别、病理分期和 TNM 分期无关（图 5A）。

2）为了评估其预测LUAD患者预后的特异性和敏感性，研究者评估了风险评分的ROC曲线下面积（AUC）值。风险评分在 1、3、5 年的 AUC 值分别为 0.760、0.754 和 0.779，这些被证明高于其他临床病理因素（图 5B）。同时，利用风险评分构建列线图，可作为临床实践中预测患者预后的定量工具（图5C）。

研究结论：以上结果表明m5C-LPS是LUAD患者的重要独立预后因素。

5、低风险和高风险群体的 m5C 状态差异

研究方法与结果：1）使用 PCA 检测 m5C 在全基因组表达谱、m5C RNA 修饰相关基因表达谱和 m5C-LPS 相关 lncRNAs 表达谱上的不同分布模式（图 6A）。 基于m5C-LPS，将患者分为低危组和高危组，与其他2种方法相比，低危组和高危组的分布更明显。 因此，m5C-LPS 可以将 LUAD 患者分为 2 组，表明预测模型的敏感性和特异性。

2）为了识别 m5C 相关 lncRNA 的异常激活信号通路进行了 GSEA，分析结果表明，m5C 相关 lncRNA 的高表达与细胞周期信号通路、DNA 复制和 P53 信号通路有关（图 6B）。

6、m5C-LPS与LUAD肿瘤免疫微环境的相关性

研究方法与结果：1）通过使用 CIBERSORT 筛选 p < 0.05 的值，CD4 幼稚 T 细胞在高风险组和低风险组中不表达，并被排除在外（图 7A）。

2）分析 21 种肿瘤浸润免疫细胞与 m5C-LPS 之间的相关性发现，其中单核细胞、树突细胞静息和静息肥大细胞在高危组中的表达高于低危组。相比之下，高风险组中活化的 M0 巨噬细胞和肥大细胞的水平低于低风险组（图 7B）。

3）进一步分析21种肿瘤浸润细胞之间的相关性发现，激活的 CD4 记忆 T 细胞与 CD8 T 细胞的相关性最强，其次是浆细胞和 M2 巨噬细胞（图 7C）。

4）研究 m5C-LPS 风险评分与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系表明，风险评分与 6 种肿瘤浸润免疫细胞亚型（B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）呈负相关（图 7D）。

研究结论： m5C-LPS的风险特征可以区分LUAD中肿瘤免疫细胞的不同特征。

文章小结

        lncRNAs与肺腺癌（LUAD）患者的预后密切相关，研究者使用 Pearson 相关分析构建了一个 5-甲基胞嘧啶 （m5C） 相关的 lncRNAs-mRNAs 共表达网络。然后使用单变量和多变量 Cox 比例风险分析来确定具有预后价值的 m5C 相关 lncRNA 的风险模型。使用 Kaplan-Meier 分析、单变量和多变量 Cox 回归分析和患者病理特征曲线分析验证风险模型。研究者还在体外验证了 m5C 相关 lncRNA 的表达水平。使用 CIBERSORT 工具和 TIMER 数据库评估风险模型与肿瘤浸润免疫细胞之间的关联。基于这些分析，总共选择了 14 个具有预后价值的 m5C 相关 lncRNA 来构建风险模型。m5C 相关 lncRNA 的风险模型可能是 LUAD 有前景的预后工具，并可能有助于LUAD患者的治疗。

全文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.671821/full