单细胞转录组揭示肺类癌的肿瘤微环境

单细胞转录组技术已被用作分析传统肺癌肿瘤细胞异质性的有力工具。但肺类癌在单细胞水平上的特征尚未确定。今天小编给大家分享一篇2022年2月22日发表在INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER（IF：7.396）上的文章，这项研究通过类癌细胞的单细胞转录组反映了肿瘤间的异质性和临床病理特征。并且为肺类癌微环境的细胞组成以及潜在的细胞间相互作用提供了全面的见解。揭示了肺类癌新的生物标志物和治疗靶点。

一、研究背景

肺癌是一种异质性疾病，包括不同的组织病理学亚型。肺类癌，也称为肺神经内分泌肿瘤或肺类癌，是一种罕见的肺部肿瘤，平均而言，肺类癌比传统肺癌有更好的预后。但是仍有疾病复发和转移扩散的风险。最近的几项单细胞研究为更常见的肺癌（如腺癌和鳞状细胞癌）的细胞异质性提供了详细的见解。然而，肺类癌在单细胞水平上的特征仍然未知。

此外，预测靶标和免疫治疗的有效性受到肿瘤内异质性的限制，其中肿瘤可能存在原发性耐药肿瘤细胞亚克隆，以及复杂的肿瘤微环境，从而影响对肿瘤的免疫反应。而单细胞基因表达谱可以克服这一限制，并已经为肺腺癌的细胞异质性提供了有价值的见解。

为了研究肺类癌中的细胞组成和单细胞基因表达谱，作者对3个类癌肿瘤和正常肺组织样本进行了单细胞RNA测序，并综合分析了肺类癌的细胞组成。通过分析类癌肿瘤细胞的单细胞基因表达谱揭示了临床病理特征。作者还发现肿瘤微环境的特征包括具有非炎症特征的单核细胞衍生的骨髓细胞、肿瘤相关的内皮细胞、一系列血管平滑肌细胞和周皮细胞以及具有癌症相关成纤维细胞样特征的肌成纤维细胞。

二、结果

1.单细胞RNA测序揭示肺类癌的细胞多样性

为了在单细胞水平上探讨肺类癌的细胞组成及其肿瘤微环境，作者从3例未经治疗的肺类癌患者(图1A)中采集了肿瘤组织和正常肺组织的新鲜组织样本。这3例患者的肿瘤细胞均显示呈巢状生长，并表达神经内分泌标记蛋白突触素和嗜色粒蛋白A(图1B)。两例非典型类癌(患者2和3)在诊断时均有区域淋巴结转移。这些肿瘤组织样本被酶解，并进行单细胞RNA测序。还有来自先前发表的队列研究(患者4-10)的7个正常肺组织样本的单细胞基因表达数据被纳入随后的分析。本研究共分析了73105个单细胞的转录组，其中经过质量控制和筛选后保留了64697个高质量的单细胞转录组(图1C)。

接下来，作者对单细胞转录组进行聚类分析的可视化，发现正常和肿瘤组织样本之间存在明显的偏态(图1D)。并且不同患者的单细胞转录组没有表现出样本间的批次效应(图1E)。此外，作者通过典型标记基因的基因表达定义了上皮细胞、免疫细胞和基质细胞(图1F)。作者发现在肿瘤组织样本中，主要包括上皮细胞和基质细胞的单细胞转录组，而在正常组织样本中，免疫单细胞转录组更丰富(图1G)。

图1：肺类癌的单细胞RNA测序。

2.肺类癌的肿瘤间异质性反映了其临床病理特征和分子亚型

作者进一步对上皮细胞重新进行聚类分析。发现正常细胞簇由不同的患者共享，而肿瘤细胞簇具有高度的患者特异性（图 2A）。在正常细胞簇中，使用典型标记基因和预定义的基因特征，作者鉴定了 1 型和 2 型肺泡上皮细胞、纤毛细胞、棒状细胞和基底细胞（图 2A、B）。作者还在患者之间的肿瘤细胞中发现了许多差异表达的基因（图 2C），如 CD44、TFF3 和 EGFR，通过免疫组化实验发现它们与差异蛋白表达相关（图2D）。为了进一步探索患者间的异质性，作者从单细胞基因表达谱中推断出不同的功能特征，即细胞周期阶段、线粒体读数的比例和信号通路活性。患者 2 的肿瘤细胞在 S 期的细胞比例最高，同时在免疫组织化学中显示出最高的 Ki67 增殖指数（图 2E）。在患者 3 的肿瘤细胞中观察到最高比例的线粒体读数，其特征是局灶性肿瘤坏死（图 2F）。患者 3 的肿瘤细胞转录组在 EGFR 通路的活性得分很高，并且在蛋白质水平上有较强的 EGFR 表达（图 2D，G）。雌激素和雄激素受体信号通路活性评分与患者性别相关（图 2G；临床特征见图 1A）。最近，已经表明，基于转录和表观遗传特征，肺类癌可以分为三个不同的分子簇。 在本项研究的单细胞基因表达谱中，作者将患者 2 和 3 的肿瘤分配到集群 A1，将患者 1 的肿瘤分配到集群 A2 和集群 B（图 2H）。值得注意的是，免疫和基质细胞区室仅表现出较小的分子簇基因特征表达分数。总之，肺类癌单细胞转录组显示出肿瘤间异质性，并且反映了不同的临床和组织形态学特征，例如患者的性别、肿瘤增殖活性和肿瘤坏死，以及最近提出的肺类癌的分子簇等。

图2：肺类癌肿瘤细胞的肿瘤间异质性。

3.肺类癌的免疫微环境以非炎症性单核细胞来源的髓样细胞为特征

作者使用典型标记基因和预定义的基因特征，将免疫单细胞转录组进行亚组化并重新聚类（图 3A、B），并鉴定了不同的淋巴细胞，例如常规 T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞、B 细胞和浆细胞（图 3A）。平均而言，肿瘤组织中淋巴细胞类型的比例与正常组织非常相似，同时还注意到肿瘤和正常组织中的一些患者间异质性（图 3C）。总之，肺类癌的淋巴微环境类似于正常肺实质的淋巴细胞室。在骨髓细胞室中，作者在肿瘤和正常组织中鉴定出具有不同丰度的单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞和肥大细胞（图 3A）。在单核细胞中，经典的单核细胞簇 2 在肿瘤组织中富集（图 3D）。常规树突状细胞由两个簇组成，其中 CD141+ 簇 1 主要存在于肿瘤组织中（图 3E）。虽然单核细胞和常规树突状细胞的比例在肿瘤与正常组织中的患者中异质性增加，但在所分析的所有三种类癌中，单核细胞来源的骨髓细胞均持续增加（P = 0.007）。单核细胞衍生的骨髓细胞的进一步特征是 SELENOP、C1QA、C1QB、C1QC 和趋化因子 CCL3 和 CCL4 的高表达（图 3F）。与正常组织相比，肿瘤组织中单核细胞衍生的骨髓细胞显示出与炎症和免疫反应相关的各种基因特征的表达分数略低（图 3G）。这一部分的分析结果表明，肺类癌免疫微环境主要由非炎症性单核细胞衍生的骨髓细胞主导。单细胞 RNA 测序分析的三种肺类癌的骨髓细胞室的组成在某种程度上是异质的。

图3：肺类癌中免疫肿瘤微环境的组成。

4.血管细胞和CAF样肌成纤维细胞构成了肺类癌的基质微环境

为了深入了解基质微环境的组成，作者使用典型标记基因和预定义的基因特征鉴定了不同的内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞簇（图 4A、B）。在内皮细胞中，作者根据预定义的标记基因特征区分支气管、毛细血管、动脉和静脉内皮细胞（图 4A）。虽然正常肺实质中存在不同亚型的内皮细胞，但肿瘤组织中支气管型内皮细胞显著富集（P =0 .007）（图 4A）。作者还发现肌成纤维细胞在肿瘤组织中高度富集 (P = 0.0074)，并表现出高表达的细胞外基质成分，如 COL1A1、COL3A1 和 COL6A3，以及基质降解酶，如 SULF1（图 4C），表明这些细胞可能参与细胞外基质重塑。此外，肌成纤维细胞的特征在于 TGFβ 信号传导通路的高活性（图 4D）。在肌成纤维细胞中，与肌成纤维细胞簇 2 ，其他成纤维细胞和平滑肌细胞簇相比，簇 1 显示 FAP 和 MMP11 的过表达以及各种胶原蛋白的较高表达（图 4E）。总之，这些数据表明肺类癌肿瘤组织中的肌成纤维细胞表现出癌症相关成纤维细胞的生物学特征。类癌的基质微环境以血管平滑肌细胞 (P = .0160) 和周细胞为主。同时，作者还发现肿瘤组织中的周细胞显示出高表达的 RGS5（一种参与周细胞发育的基因）和 ACTA2（一种平滑肌标记基因）（图 4F）。我们发现这些基因以分级方式表达，这表明肿瘤组织中的周细胞和血管平滑肌细胞形成一个连续体，而不是离散的细胞类型（图 4G）。

图4：肺类癌的间质肿瘤微环境的组成。

5.肿瘤微环境细胞之间的相互作用可能激活NOTCH、VEGF、TGFβ和JAK/STAT信号

接下来，作者观察到不同的细胞类型在肺类癌微环境中特别富集（图 5A）。为了描绘微环境和肿瘤细胞之间的功能关系，作者量化了潜在的旁分泌受体-配体相互作用。在基质微环境的细胞类型之间发现了大多数潜在的相互作用，包括肿瘤相关的内皮细胞、肌成纤维细胞、血管平滑肌细胞和周细胞，而肿瘤细胞较少参与潜在的旁分泌相互作用（图 5B)。此外，作者发现许多相互作用可能激活 NOTCH、TGFβ、VEGF 和 JAK/STAT 信号（图 5C）。肿瘤相关内皮细胞接收潜在的 VEGF、TGFβ 和 NOTCH 通路激活信号，而肌成纤维细胞主要通过各种旁分泌和自分泌相互作用接收潜在的 TGFβ 通路激活信号。树突状细胞、单核细胞和单核细胞衍生的骨髓细胞主要通过与其他免疫细胞的自分泌和旁分泌相互作用接收潜在的 JAK/STAT 通路激活信号。这些结果表明，各种基质细胞和免疫细胞之间的自分泌和旁分泌相互作用可能会塑造肺类癌肿瘤的微环境。

图5：肺类癌微环境中潜在的旁分泌作用。

三、总结

这篇文章首次全面探究了肺类癌的细胞组成成分，揭示了其肿瘤微环境的非炎症性和富含血管的特性，并概述了相关的细胞间相互作用，这些发现可能作为未来的治疗方向。

参考文献

1. Bischoff, P., Trinks, A., Wiederspahn, J., Obermayer, B., Pett, J.P., Jurmeister, P., Elsner, A., Dziodzio, T., Ruckert, J.C., Neudecker, J. et al. (2022) The single-cell transcriptional landscape of lung carcinoid tumors. Int J Cancer, 150, 2058-2071.