肿瘤circulating miRNA预后模型构建
生信干货
ammy ·2020年12月26日 01:35
今天给大家分享的是一篇10月发表于Molecular Oncology（IF：6+）关于circulating miRNA 预后模型的文章。
本文验证了4-circulating microRNA的预后模型可以准确预测DLBCL患者，疾病的复发和预后，更好的理解在淋巴瘤形成过程中，肿瘤微环境的作用。这个生物标志物可以为DLBCL临床实践中的危险分层做出参考。DLBCL是diffuse large B-cell lymphoma 缩写，最B淋巴细胞癌变的临床名称。一般利用利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙可以改善DLCBL，但是很难对预后做出判断。多种miRNA在淋巴细胞发育和恶性转化中发挥重要作用，有miR21、miR130b、miR148a、miR155和miR181。但是没有建立循环miRNA预测模型。Ras蛋白，Ras亚型(H-Ras, K-Ras，直接激活Ras信号的N-Ras基因已经在淋巴瘤中发现。并且Ras级联通可作为肿瘤微环境中的免疫抑制组分，而引发癌症。DLBCL患者包括discovery 队列和training队列。Discovery 队列中有被诊断，治疗后缓解但是又复发的20名患者。Training 集包括279名接受R-CHOP治疗的患者，样本情况如下表所示。对discovery 队列进行miRNA 阵列分析，训练集和验证集的血清样本进行实时定量PCR，评估miRNA预测因子。对223例患者样本进行全外显子组测序，另外135例样本FFPE肿瘤组织基于WES和WGS结果进行靶向测序。对52例患者肿瘤组织进行RNA测序，分析患者肿瘤样本的基因表达谱和肿瘤免疫表型(TIP)。然后进行reads比对和数据标准化处理。差异基因表达分析参考DAVID数据库，然后进行GO注释和基因富集分析GSEA。TIP分析推断肿瘤浸润组织的免疫细胞比例。首先关注在诊断和缓解之间以及复发和缓解之间显著变化的8个miRNA。其次，为了确保稳健性，文章选择了其中的四个在训练队列的20例复发患者和80例非复发患者的血清样本中验证后，发现有显著miRNA (miR21, miR130b, miR155和miR28)用于模型建立。根据miRNA表达水平的线性组合，计算每位患者的风险评分（RSF），公式如下：
Sij为miRNA j对样本i的风险评分，Wj为miRNA j风险评分的权重，权重由logistic回归分析得出的系数得到。采用中值miRNA签名风险评分作为分界点，将患者分为低风险组和高风险组。评估个体miRNA和4循环miRNA模型的预后潜力，生成ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)。文章选取了b淋巴瘤细胞株OCI-LY10体外培养细胞，并随后进行了总RNA提取和实时定量PCR。经过引物设计和Western blot 显色，计算免疫反应评分（IRS）。DLBCL中4-circulating miRNA模型建立如图1所示，为了系统地评估circulating miRNA特征，并确定其与淋巴瘤复发的关系，通过对20例DLBCL患者诊断、缓解和复发时血清样本中372个miRNA的miRNA PCR阵列分析，得到miRNA的表达谱。与缓解期血清miRNA水平相比，确诊期5个miRNA显著升高，23个miRNA降低，复发时7个miRNA升高，18个miRNA降低(图1B)。用于进一步验证的miRNA的入选标准是淋巴瘤相关miRNA上调(miR21、miR130b和miR155)或下调(miR7、miR28、miR128、miR424和miR454)，在确诊和缓解之间，或复发和缓解之间，平均fold change > 2.5, p值< 0.05(图1C)。图1，DLBCL中4-circulating miRNA模型建立4-circulating miRNA预后模型与疾病复发的关系为了确定4-circulating miRNA模型与疾病复发的关系，对DLBCL训练队列和验证队列进行了ROC分析，检测每个miRNA和4-circulating miRNA预后模型对复发和缓解的预测准确性。图2显示了训练队列和验证队列每种miRNA和4-circulating miRNA预后模型的真阳性率、假阳性率、假阳性率和真阳性率(图2A-B) 。并使用单变量分析和森林图来可视化临床特征的分布。在训练队列(HR = 16.83, P < 0.001，图2C)和验证队列(HR = 14.97, P < 0.001，图2D)中，4-circulating miRNA模型与复发风险显著增加相关。图2，4-circulating miRNA预后模型与疾病复发的关系4-circulating miRNA预后模型与生存时间的关系如ROC曲线所示，曲线下的面积(AUC)在训练队列为0.871，在验证队列为0.866(图3A)。根据4-circulating miRNA模型的加权系数，采用风险评分来区分复发的低风险和高风险。在训练队列中，随访时间中位数为21.0个月(范围:0.2-88.0个月)，2年PFS为64.4%，OS为79.4%。通过单因素分析，2年高危患者PFS和OS分别为34.5%和62.4%，明显低于4-circulating miRNA模型的低风险患者(91.4%和95.0%，P均< 0.001，图3B)。在验证队列中，随访时间中位数为35.0个月(范围:0.2-58.0个月)，2年PFS和OS分别为83.0%和89.7%。通过单因素分析，高危患者2年PFS和OS分别为51.7%和73.3%，显著低于4-circulating miRNA模型的低风险患者(94.5%和95.7%，P均< 0.001，图3 c)。图3，4-circulating miRNA预后模型与生存时间的关系4-circulating miRNA预后模型与致癌信号通路的关系使用MIRPATH v.3软件，214个信号通路被鉴定与miR21, miR130b, miR155和miR28相关。通过RNA测序数据的GO分析，在4-circulating miRNA模型中，低风险组和高风险组之间有190个信号通路具有表达差异(图4)。MIRPATH v.3和GO分析均发现了11个信号通路。重要的淋巴细胞相关通路是Ras蛋白信号转导、细胞因子介导的信号通路、凋亡过程的正调控、血管生成、细胞增殖的负调控和先天免疫应答(图4B)。GO显示，参与Ras蛋白信号转导的基因有67个。其中，至少有一种miRNA靶向选择23个基因，并进一步选择它们进行基因-基因相互作用分析(图4C)。同时，网络分析(图4D) 表明IGF1与RRAS显著相关，FGF2 PLD1 TP53 DOK1 CNKSR1 DHCR24，RIT1, NTN1, PARK7, SHC1, RALGDS, CDKN1A，RB1、SOS1、NF1、CDKN2A和JUN的表达与SHC1、RALGDS、CDKN1A、RB1、SOS1, NF1, CDKN2A, GRAP2, MRAS, ADRA2A，LAT、RRAS、FGF2、PLD1和TP53表达相关。进一步分析表明，IGF1和JUN 与4-circulating miRNA模型及各miRNA表现出显著相关性(IGF1, R = 0.408，P = 0.006, R = 0.427, P = 0.002, R = 0.225，P = 0.079, R = - 0.410, P = 0.003, R = 0.371，P = 0.007;JUN，R = 0.331, P = 0.019, R = 0.297，P = 0.034, R = 0.351, P = 0.018, R =−0.152，P = 0.158, R = 0.445, P < 0.001;图4 e)。52 例DLBCL患者的免疫组化显示的肿瘤标本中IGF1和JUN蛋白水平在高危组的发生率高于低危组(P = 0.016和P = 0.020，图4F)。生物信息学分析预测了IGF1启动子与miR130b的潜在结合位点(图4 g)。荧光素酶报告基因实验显示，miR130b在HEK-293T细胞正向调控IGF1启动子区域的转录活性(- 674-667 bp，P = 0.001，图4 h)。GSEA分析(图4I)显示，与Ras低风险组相比，Ras高危组的免疫相关通路显著下调，包括免疫系统发育(P = 0.015)，先天免疫应答(P = 0.030)，调节细胞因子的产生参与免疫反应(P = 0.008)和调节体液免疫反应(P = 0.028)。
图4，4-circulating miRNA预后模型与致癌信号通路的关系4-circulating miRNA预后模型与Ras介导的肿瘤免疫的关系免疫细胞免疫活性评分采用TIP分析，包括T细胞亚群、单核细胞、巨噬细胞、MDSC、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞。在4-circulating miRNA模型中，高风险组MDSC和Th17细胞含量明显高于低风险组(P = 0.011和P = 0.036，图5A)。重要的淋巴细胞相关通路包括细胞增殖的负调控、先天免疫应答、细胞因子介导的信号通路、Ras蛋白信号转导、凋亡过程的正调控和血管生成(图5B)，表明4-circulating miRNA预后模型与Ras介导的肿瘤免疫具有相关性。前文提到的体外细的培养体系中，与对照细胞相比，敲除miR21、miR130b和过表达miR28显著降低IGF1表达(P = 0.005, P = 0.020, P = 0.019)和MDSC百分比(P = 0.005，P = 0.042和P = 0.005，图5C)此外，与对照组细胞相比，miR21和miR155的沉默降低了JUN的表达(P = 0.001和P = 0.001)和Th17细胞的百分比(P = 0.002和)P < 0.001，图5D)。免疫荧光实验进一步证实，当同时转染B淋巴瘤细胞miR21、miR130b、miR155的抑制剂和miR28的类似物时，MDSC和Th17相关基因在高危和低危患者中表达不同(图5E)。在DLBCL患者中，血清miR21与TGFB1有显著相关性(R = 0.378, P = 0.006),IL-6表达(R = 0.312, P = 0.024)、血清miR130b与IL-6表达(R = 0.323, P = 0.019)、血清miR155与TGFB1表达之间的关系(R = 0.341, P = 0.013)和IL-17D表达(R= 0.325, P = 0.019)，以及血清miR28和IL-17D表达之间的差异(R =−0.501,P < 0.001，图5F)。这些发现表明4-circulating miRNA模型与DLBCL中含有免疫抑制成分的Blymphoma细胞的相互作用有关。图5，4-circulating miRNA预后模型与肿瘤免疫的关系总的来说，文章格式规范，利用临床患者诊断和复发瘤样本作为发现集，训练集和验证集，再结合实验完成miRNA的沉默，进而验证miRNA对于肿瘤微环境和免疫应答相互作用，同时证明了构建的4-circulating miRNA模型可以有效预测DLBCL的复发和生存。另外启发我们是否可以扩展到别的肿瘤样本进行断层研究呢，这个很值得思考。https://biosxr.gaptools.cn/#/
