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Hi-C多组学生信分析思路分享

生信干货 xu ·2019年8月8日 23:19

到底是什么导致了原癌基因KLF5的激活？

基于TCGA多种癌症体细胞突变数据，结合Hi-C+ChIP+RNA多组学技术，对KLF5进行了系统的分析，分析内容层层递进，验证结果充足。

KLF家族对于细胞的发育，癌症的发生扮演着重要的角色，已有研究表明KLF5的扩增会导致癌细胞的恶性增殖，但对于KLF5的调控关系以及作用机制并没有很深的刻画，今天小编就和大家分享这篇发在Cancer Discovery的文献《Somatic super-enhancer duplications and hotspot mutations lead to oncogenic activation of the KLF5 transcription factor IF：26.37》

在癌症发生的过程中，基因的改变会导致原癌基因的激活从而造成基因表达调控的紊乱，例如拷贝数扩增会导致MYC, MYCN, AR, MITF and SOX2基因表达的上调。此外，已有报道在一些非编码区域的突变导致了distal enhancer 或super enhancer对ESR1 and TAL1 基因表达的激活。KLF家族在发育和疾病中起着重要的作用，KLF5 是重要的原癌基因。文章系统的研究了编码区域和非编码区域序列的改变对于KLF5的影响，结果表明KlF5 的enhancer序列的改变会导致KLF5的激活，从而导致了细胞的恶性增殖。

（1）拷贝数变异分析

基于TCGA 33种癌症10844个样本进行了GISTIC (Genomic Identification of Significant Targets in Cancer) 分析。

（2）细胞系来源

细胞系来源于Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) project ，主要用于功能验证。

（3） ChIP-seq 分析

抗体: H3K27ac (Abcam, ab4729), KLF5 (Abcam, ab137676), p300 (Bethyl Lab, A300-358), V5 (Thermo Fisher, R960- 25). 基因组版本:hg19 , 对:BWA, Peaking Calling : MACS2 ,Motif : SeqPos motif tool。

（4） Super enhancer 鉴定

多个细胞系的H3K27ac 合并成一个数据，并通过MACS2进行peak calling ，通过 ROSE pipeline 来鉴定super enhancer。

（5） 3C 验证

选取BICR31 和 BICR6 细胞系进行了3C实验，限制性内切酶为BglII。

（6）BETA 分析

Binding and Expression Target Analysis (BETA) 主要结合CHIP数据和RNA数据用于评估转录因子对基因表达的影响。

针对TCGA的样本，作者通过分析6例头颈鳞癌的WGS数据发现在KLF5和KLF12中间一段～600kb的非编码区域有着明显的扩增。

此外发现这～600kb扩增（cluster of e1,e2,e3,e4）区域在各细胞系（8例头颈鳞癌，3例食管癌，3 胃腺癌）显著富集H3K27ac的信号，暗示着这块区域是潜在super enhancer。

Enhancers 对基因表达的调控主要是通过与基因的promoter区域在空间上进行互作，这些空间上的互作被严格的限制在TAD的内部。

通过公共的IMR90细胞系的hic数据，发现发生扩增的enhancer (e1,e3，e4)和KlF5恰恰在同一个TAD内，而KLf12则处于TAD的边界上，

这暗示着发生扩增的enhancer可能对KLF5有调控作用。

作者同时利用3C技术验证了e1,e3,e4 和KLF5在空间上有互作。

文章构建了头颈鳞癌细胞系BICR31（～600kb enhancers 扩增）CRISPR抑制系统，通过招募sgRNA抑制e1,e3,e4的功能。

通过QPCR发现只有e1,e3,e4同时被抑制时，KLF5基因的表达才显著下调。

在充分研究了e1,e3,e4对KLF5的调控机制后，通过KLF5的CHIP实验，发现 KLF5 更多的和H3K27ac绑定起到super enhancer的作用。

文章还研究了KLF5对于其他基因的调控作用,通过Bind and Expression Target Analysis （BETA），可以发现 KLF5更多的是起激活的作用（如图D）。

从图中可以看到，KLF5 转录因子和H3K27ac组蛋白信号显著富集于头颈鳞癌细胞决定KRT6A以及癌症相关基因ID1，LAMA3以及CCND1，暗示着KLF5有着显著的调控作用。为了验证这一结果，作者敲除了lD1附近的结合位点（e1,e2）,发现lD1的表达显著下降，说明KLF5对ID1有着直接的调控作用。

除了～600kb的noncoding enhancer 发生扩增之外，KLF5本身也会发生变异。通过对TCGA 1000多个肿瘤样本进行调研，发现KLF5经常会发生两种变异（如上图）。这两种变异通常在phospho-degron结构域（CPDs）

通过对野生型以及第二种CPD（D418N，E419K,E419Q）的motif 进行分析，第5到第6位单核苷酸突变导致三者结合模式发生了变化。

相对于野生型，KLF5突变型E419Q独有的5,611个位点有着独特的结合模式。

这些独有的，新获得结合位点与基因表达的激活密切相关，例如E419Q新结合位点形成了新的super enhancer 驱动着癌症相关因子FOXE1，NAMPT的表达。

最终文章拨开了重重迷雾，从基因，转录，翻译等角度我们揭示了KLF5的调控机制以及作用机制。

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