大家好呀！今天给大家介绍一篇2021年2月发表在nature communications（IF:14.919）上的文章。本研究对10例鼻咽癌（NPC）肿瘤-血液的176447个细胞进行单细胞转录组测序，得到53种细胞亚型，包括肿瘤浸润性CD8+ T细胞，调节性T细胞（Treg），树突状细胞（DCs）和恶性细胞。CD8+ T细胞和免疫抑制性TNFRSF4+ Treg细胞可能分别来源于血液CX3CR1+ CD8+ T细胞和初始Treg细胞。此外，作者鉴定到具有免疫调节和耐受性LAMP3+ DCs细胞。作者还鉴定到LAMP3+ DCs细胞，Treg细胞，耗竭CD8+ T细胞和恶性细胞之间的细胞间相互作用。总的来说，作者的研究揭示了鼻咽癌在单细胞水平上的肿瘤微环境的异质性和相互作用，为鼻咽癌发展机制和鼻咽癌精确治疗提供了有价值的信息。

Tumour heterogeneity and intercellular networks of nasopharyngeal carcinoma at single cell resolution

鼻咽癌单细胞水平的肿瘤异质性和细胞间网络

结果：

1.鼻咽癌患者肿瘤和PBMC细胞的组成

对10例鼻咽癌（NPC）患者的肿瘤组织和外周血单核细胞（PBMC）进行单细胞转录组测序（图1a）。质控和过滤后共获得176447个细胞，包括肿瘤细胞82622个和PBMC细胞93825个，每个细胞约有1500个基因。使用R包Seurat对数据进行UMAP聚类共鉴定到CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，髓系细胞，恶性细胞，B细胞和NK细胞（图1b）。与PBMC相比，肿瘤组织中CD8+ T细胞和B细胞比例较多而NK细胞比例较少，表明肿瘤组织和外周血之间的免疫情况不同（图1c）。此外，作者使用公共单细胞数据集比较NPC和其他癌症的细胞组成，NPC中T细胞比例较高。

2. T细胞异质性和TCR多样性

接下来，作者研究T细胞和NK细胞的异质性和潜在功能亚型。作者将141875个T细胞和NK细胞分为32个亚型，主要为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞（图2a）。为鉴定细胞类型特异表达基因，作者对T细胞簇进行差异分析。在肿瘤样本的CD4+和CD8+ T细胞中LAG3,TIGIT,PDCD1,CTLA4等标志物过表达。已有研究表明肿瘤浸润T细胞中衰竭基因和效应基因共表达。总的来说，T细胞具有抗肿瘤作用，但他们的功能在TME中受到一定抑制。然而在PMBC中T细胞中的TCF7,SELL,CCR7和LEF1高表达。此外，作者在肿瘤组织中鉴定到特异表达的初始T细胞标志物和促炎细胞因子。接下来，作者进行TCR分析，有38720个T细胞具有可检测的TCRα-β对或克隆型T细胞。患者中CDR3序列变异最多，其中CAVRGTGTASKLTF和CASSFSGANVLTF与VDJ数据库中的MLANA和EBV抗原识别有关。此外，肿瘤样本的CD4+和CD8+ T细胞具有更多的克隆型T细胞。

3. CD8+ T细胞多样性和肿瘤内CD8+ T细胞的衰竭

在NPC样本中鉴定到62244个CD8+ T细胞，分为11个亚群，包括两个naïve，血液中心记忆，血液效应记忆，高迁移，肿瘤中心记忆，肿瘤效应记忆，肿瘤中心记忆，高增殖和耗竭T细胞等（图2a和2b）。NPC肿瘤组织中大多数为CD8_C6_IL7R,CD8_C7_GZMK,CD8_C8_MHC,CD8_C9_XCL,CD8_C10_MKI67和CD8_C11_PDCD1，而PBMC中大多数为CD8_C5_CX3CR1,CD8_C1_LEF1,CD8_C2_TCF7,CD8_C3_KLRB1和CD8_C4_KLRG1。为评估CD8+ T细胞的功能状态，作者计算CD8+ T细胞簇的细胞毒性，增殖和衰竭打分，其中CD8_C5_CX3CR1的细胞毒性打分最高，CD8_C10_MKI67的增殖打分最高，CD8_C11_PDCD1的衰竭打分最高，表明他们具有潜在的细胞毒性，增殖和衰竭功能。差异分析表明CD8_C5_CX3CRA中趋化因子受体，S1P受体和整合素高表达，其负责调控CD8+ T细胞的迁移。差异基因的富集分析表明，肿瘤细胞毒性CD8+ T细胞簇富集于细胞因子产生和淋巴细胞激活等相关通路，CD8_C5_CX3CR1富集于白细胞跨内皮细胞迁移和白细胞迁移相关通路。时序轨迹分析表明，CD8_C5_CX3CR1细胞处于初始状态，CD8_C10_MKI67处于中间状态，CD8_C11_PDCD1处于最终状态（图2c）。CD8_C11_PDCD1和CD8_C10_MKI67的迁移率最高，其次是CD8_C7_GZMK,CD8_C8_MHC和CD8_C9_XCL1（图2d），CD8_C5_CX3CR1在CD8+ T细胞中的扩张流动性最高（图2e），CD8_C5_CX3CR1在肿瘤组织和PBMC中的TCR比例最高（图2e）。

4.NPC中Tregs细胞的多样性和轨迹

Treg细胞是免疫细胞的有效抑制因子，对免疫耐受和稳态十分重要。本研究共鉴定到11631个Treg细胞，共四个亚群。肿瘤组织中Tregs的细胞比例较高，肿瘤组织中大多数为Treg_C4_TNFRSF4细胞，Treg_C2_HSPA1A和Treg_C3_MKI67细胞，而PBMC中大多数为Treg_C1_SELL细胞。使用R包Seurat计算Treg细胞的IL2R打分研究Treg细胞的免疫调节功能，其中Treg_C4_TNFRSF4的IL2R打分最高，其抑制和共刺激打分最高（图3a）。此外，Treg_C4_TNFRSF4中趋化因子受体的表达水平较高，包括CXCR3,CXCR6和CCR8。通路富集分析表明，Treg细胞参与不同的通路。其中，Treg_C4_TNFRSF4富集于细胞因子-细胞因子受体互作（图3b），Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C2_HSPA1A富集于白细胞介素-10生存，TNF信号通路和NF-KB信号通路（图3b）。GSEA分析表明Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C2_HSPA1A的细胞周期、趋化因子、TGF-β和T细胞增殖负调控相关通路富集程度较高。随后对肿瘤组织和PBMC的Treg细胞进行轨迹分析（图3c）。TCR分析表明有17621个Tregs细胞为克隆型，其中Treg_C4_TNFRSF4的克隆细胞比例最大。Treg_C4_TNFRSF4的扩增打分最高，表明克隆扩增程度最高（图3d）。PBMC中的Treg_C1_SELL的迁移打分最高，表明迁移率最高（图3d）。差异分析表明Treg_C1_SELL中趋化因子受体CCR4高表达。进一步研究Treg_C2_HSPA1A和Treg_C4_TNFRSF4与其他Treg细胞的移动性，Treg_C4_TNFRSF4细胞和Treg_C3_MKI67细胞的迁移率最高，其次是Treg_C2_HSPA1A和Treg_C1_SELL细胞，Treg_C2_HSPA1A细胞与Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C3_MKI67细胞的过渡迁移率较高（图3e）。

5. NPC样本中B细胞多样性

共鉴定到22892个B细胞，分为9个亚群。其中，B_C1_TCL1A、B_C2_FCRL3和Plamsa_C1_IgA簇来自PBMC，其他6个簇来自肿瘤样本。差异分析表明肿瘤组织中B细胞簇的独特基因特征，B_C6_HSPA1A具有应激基因表达，Plasma_C2_IgG中IgH基因表达水平较高。相关性分析表明TCL1A表达水平与IGHM和IGHD高度相关。差异分析的富集分析表明，B细胞簇中富集与免疫调节相关的通路。

6. NPC中肿瘤相关LAMP3+ DCs具有耐受性表型

共鉴定到8893个髓细胞，分为10个亚群，包括肥大细胞，5个单核细胞或巨噬细胞，4个树突状细胞（图4a）。树突状细胞中，DC_C2_CD1C、DC_C3_LAMP3和DC_C4_JCHAIN来源于肿瘤，DC_C1_FCER1A来源于外周血，其中DC_C3_LAMP3具有具有高度成熟，激活和迁移潜能的DCs（图4b）。此外，DC_C3_LAMP3细胞具有高表达的特殊趋化因子配体(CCL17、CCL19和CCL22)，这些配体能够召集表达趋化因子受体CCR4、CCR7和CXCR3的免疫细胞(图4b)。标记基因LAMP3与DC_C3_LAMP3中与成熟、迁移、激活和趋化因子配体相关的其他功能基因的表达显著相关。GO和KEGG功能和通路富集分析表明，DC_C2_CD1C的“抗原加工和呈递”显著上调，而DC_C3_LAMP3的“抗原加工和呈递”下调，DC_C3_LAMP3中凋亡、NF-κ b和MAPK信号通路以及髓细胞分化上调（图4c）。DC_C3_LAMP3的分化和凋亡水平最高，但抗原提呈水平最低(图4d)。轨迹分析表明，DC_C1_FCER1A细胞分化为DC_C2_CD1C和DC_C3_LAMP3两个分支，其中DC_C3_LAMP3细胞的伪时间打分最高，即分化和成熟程度最高（图4e）。结合免疫调节和抗原呈递评分，这些结果表明外周血中的DC_C1_FCER1A细胞可能浸润到肿瘤，转化为抗原呈递能力增强的DC_C2_CD1C细胞，并转化为免疫抑制的DC_C3_LAMP3细胞(图4e)。

7. 不同EBV状态的恶性细胞的异质性

在NPC样本中鉴定到2787个恶性上皮细胞（图5a）。由于EBV与NPC恶性转化和肿瘤发生有关，作者分析恶性细胞中EBV的表达水平并将其分为EBV+和EBV-恶性细胞（图5b和5c）。EP_C1_LMP1细胞中EPHA2和EGFR高表达（图5d），与EBV易感性有关。此外，EBV编码蛋白（LMP1）的免疫荧光染色实验表明鼻咽癌中存在EBV+恶性细胞和EBV-恶性细胞（图5e）。通路富集分析显示EP_C1_LMP1富集细胞因子介导的、细胞死亡、凋亡和癌症相关通路的调控(图5f)。

8. NPC的细胞内互作网络

为研究NPC的细胞通讯网络，作者使用CellPhenoDB软件研究NPC组织是PBMC的不同细胞簇间潜在的配体-受体结合。DC_C3_LAMP3细胞、Treg细胞和CD8_C11_PDCD1之间存在抑制、共刺激分子或趋化因子强烈的细胞相互作用(图6a,和图6b)。其中，DC_C3_LAMP3细胞通过CCL17-CCR4和CCL22-CCR4与外周血Treg_C1_SELL细胞相互作用（图6a）。Treg_C4_TNFRSF4细胞上CTLA4、ENTPD1、CSF1高表达，DC_C3_LAMP3细胞上配体受体结合CD80/CD86，提示Treg_C4_TNFRSF4与DC_C3_LAMP3细胞之间存在潜在的相互作用（图6a）。DC_C3_LAMP3细胞通过CD200- CD200R信号通路与CD8_C11_PDCD1细胞相互作用，是一个参与抑制抗肿瘤反应的非经典免疫抑制途径（图6b）。Treg_C4_TNFRSF4与CD8_C11_PDCD1细胞之间存在潜在的配体-受体相互作用，包括趋化因子(CCL4-CCR8)、粘附连接(ITGAL-ICAM1和SELPLG-SELL)和免疫调节(HAVCR2-LGALS9)（图6b）。这些结果表明，DC_C3_LAMP3、Treg_C4_TNFRSF4和CD8_C11_PDCD1细胞在NPC肿瘤中广泛存在免疫调节相互作用。免疫荧光染色表明DC_C3_LAMP3细胞中CD80表达，Treg细胞中CTLA4表达，DC_C3_LAMP3细胞中PD-L1表达，CD8+ T细胞中PD-1表达（图6c和6d）。在恶性细胞和免疫细胞中，EBV+ EP_C1_LMP1细胞中存在更多的受体-配体相互作用。EP_C1_LMP1-细胞中的CX3CL1与CD8_C5_CX3CR1细胞、DC_C1_FCER1A细胞、NK细胞和单核细胞中的CX3CR1存在相互作用，表明EP_C1_LMP1细胞对外周血免疫细胞具有趋化潜能。以上结果表明，NPC患者中存在广泛的细胞间相互作用。

结论：

以上结果表明，作者从单细胞水平全面分析了鼻咽癌患者的肿瘤微环境异质性并鉴定可能参与鼻咽癌发生的重要细胞和分子，为了解鼻咽癌的发展机制和潜在的治疗策略提供有价值的信息。然而，本研究还存在一定局限性还需要一定的功能验证来研究其细胞间互作网络的潜在机制。