肿瘤的发生和发展有赖于多种机制，其中很重要的一个方面就是免疫逃逸-躲避免疫系统的识别和消灭。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的脑肿瘤之一，具有高度浸润性，在转录回路和表观遗传环境中也表现出异质性，因此免疫治疗难以开展。GBM中存在四种不同的肿瘤细胞状态，但第四种肿瘤细胞状态，称为“间充质样”，与其他亚型相比，间充质样状态的肿瘤微环境免疫浸润显著增加。了解GBM间充质样细胞状态的病因学及其相关转录亚型的起源对于阐明免疫逃避的机制非常重要。

2021年4月14日，英国爱丁堡大学Steven M. Pollard研究团队在 Cell (IF: 40.407) 发表了题为 Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion 的文章。研究人员们通过构建一组同基因小鼠GBM起始细胞，揭示了表观遗传免疫编辑可能通过重塑肿瘤免疫微环境，在最具侵略性的间充质GBM亚型中驱动获得性免疫逃避程序。

结果

一、工程化GSCs通过免疫活性宿主连续移植获得免疫逃避能力

GBM由具有神经干细胞（NSC）特征的细胞驱动。研究人员通过已经确定的遗传性GBM驱动突变（EGFRvIII或PDGFRA过表达，或CRISPR/Cas介导的Nf1、Pten、Trp53敲除），在C57BL / 6 J（BL6）小鼠中分离的NSC的同基因GBM干细胞：首先用Pten、Trp53双敲除模拟人间充质GBM，接着用GFP+NP细胞移植到免疫功能低下小鼠体内，进一步进行EGFRvIII过表达，形成三重突变细胞系（NPE）（图1 A-E）。由此观察到具有GBM预期特征的体内极具侵略性的肿瘤生长和浸润。与此同时，研究人员生成了一种与肿瘤前体亚型相对应的肿瘤起始细胞系，称为“ PPP”， 并与NPE细胞进行比较，对此研究人员选择用NPE模型以探索免疫逃避机制。

研究人员首先证实NPE细胞在免疫活性的同基因BL6宿主中是致瘤性的（图1G-H），并推断，具有获得性免疫逃避能力的细胞可以通过从新鲜宿主连续移植这些细胞，结果表明NPE-IE细胞具有免疫逃避能力。（图I-J）。

二、免疫逃避NPE-IE肿瘤具有高度免疫抑制微环境

为了证实NPE-IE肿瘤是否由于逃避T细胞清除的能力而更具侵袭性，研究人员做了三方面的工作：

首先，研究人员用NPE，NPE-BL6-TD和NPE-IE肿瘤敲除BL6小鼠中的CD8 T细胞群，观察到肿瘤生长加速，肿瘤外显率逐渐增加。说明免疫逃逸型NPE-IE肿瘤的微环境免疫抑制程度很高，可以逃脱CD8 T细胞的清除。

接下来，利用流式细胞术，研究人员描述并比较了非肿瘤脑组织中存在的免疫细胞类型与NPE或NPE-IE肿瘤脑组织中存在的免疫细胞类型。在脑肿瘤中，观察到总的脑免疫细胞库发生了重大变化（图2A-2F），包括：

（1）巨噬细胞和CD8/CD4 T细胞（M1和M2样巨噬细胞的标志物）显著增加，小胶质细胞明显减少。

（2）脑肿瘤中的淋巴群显示出功能障碍的标志物，如PD-1和TIM3的表达。

（3）肿瘤和邻近组织的荧光免疫组织化学表明主要的巨噬细胞群（F4/80+Iba1+）局限于肿瘤块，并且在整个大脑中通常不增加。

最后，研究人员直接分离肿瘤肿块以进一步表征肿瘤免疫微环境。多参数流式细胞术数据显示（图3A-E）：

（1）相对于NPE肿瘤，NPE-IE肿瘤中的免疫细胞浸润增加。

（2）NPE-IE肿瘤中的单核细胞骨髓源性抑制细胞和巨噬细胞显著增加，肿瘤浸润巨噬细胞表达的PD-L1水平显著高于小胶质细胞。

（3）在每个病例中，巨噬细胞表现出典型的吞噬和抗原呈递表型以及免疫抑制标记物PD-L1。

三、阻断CSF-1R信号降低NPE-IE细胞的免疫逃避能力。

为了确定NPE-IE肿瘤中增加的巨噬细胞是否支持免疫逃避，研究人员在BL6小鼠中使用针对CSF-1R的阻断抗体去清除这些细胞。结果表明(图3E-I)：

（1）其存活率的提高，甚至清除了大型的NPE-IE肿瘤。相反的，在免疫功能低下的NSG移植对照组中，这种治疗没有显著影响。

（2）虽然NPE-IE肿瘤中各种T细胞群的频率没有显著差异，但我们确实发现PD-1和LAG3标记物阳性的CD8和CD4 T细胞群增加。

（3）两种肿瘤类型中的巨噬细胞对PD-1配体PD-L1的表达呈高度阳性。

（4）小胶质细胞对LAG3配体MHC-II的表达呈阳性。

 由此可得，免疫逃逸型NPE-IE肿瘤可以逐渐逃逸CD8 T细胞的清除，NPE-IE肿瘤中的骨髓源性抑制细胞和巨噬细胞显著富集。

 四、免疫逃避细胞在免疫攻击后经历显著的转录重组

为了揭示获得性免疫逃逸机制，研究人员对其基因组、转录组和表观基因组进行了表征，发现与亲本、野生型NSC相比，NPE和NPE-IE细胞的核型分析和全基因组测序均未显示出明显的遗传破坏。

接下来，研究人员对一组细胞进行了mRNA-seq分析，包括单个突变系和来源于NSG肿瘤的细胞。在单个突变系中，Nf1缺失突出表现为转录组最接近完全转化的NPE突变体，然而，免疫逃避株获得了显著不同的转录模式，这不能单独用Nf1缺失来解释，其中包括许多免疫相关基因和GO terms。

最后，研究人员注意到NPE-IE细胞中几种趋化因子的上调，特别是Ccl9，其与促肿瘤微环境的建立有关；更令人惊讶的是Irf8表达的激活。综上所述，推测是由于体内免疫攻击免疫逃逸型NPE-IE肿瘤使其启动了与骨髓相关的转录程序，出现了巨噬细胞的持续信号传导。

五、表观遗传免疫编辑为NPE-IE系的免疫逃避奠定了基础

鉴于体内免疫攻击后诱导的转录变化在体外扩增后稳定保留，研究人员推断表观遗传的变化或许能解释免疫逃逸的问题。于是研究人员利用亚硫酸氢盐还原代表性测序（RRBS）分析了全基因组DNA甲基化模式。研究结果发现（图5A-E）：

（1）主成分分析（PCA）分析显示了三个不同的组，NPE-BL6-TD和NPE-IE细胞系通过PCA特别紧密地聚集在一起。

（2）体内移植的细胞中存在显著的低甲基化。

（3）与NPE细胞相比表现出广泛的低甲基化。

（4）与mRNA-seq数据一致，免疫逃避细胞中的许多差异去甲基化基因与免疫过程有关。

（5）其中一个最显著的差异甲基化区域出现在Irf8启动子区域和基因体中，NPE-BL6-TD和NPE-IE系中的甲基化逐渐消失，与转录激活增加一致。

通过分析全基因组DNA甲基化，发现显著的甲基化差异区在Irf8启动子区域。

六、Irf8在体外对NPE细胞中的IFNγ和TAMs有反应，对免疫逃避有重要作用

已知Irf8是通过IFNγ诱导的STAT1信号在巨噬细胞中诱导的，因此研究人员推测来自免疫TME的慢性IFNγ信号可能会刺激NPE细胞中Irf8表达的激活，于是其通过将免疫原性NPE细胞暴露于IFNγ来直接在体外进行了测试，发现（图6A-E）：

（1）IFNγ处理后Irf8在NPE-BL6-TD或NPE-IE细胞中可以更快地被刺激到更高的水平。

（2）I型IFN信号传导（通过IFNγ处理诱导）无法在体外免疫的NPE细胞中诱导与IFNγ相同程度的Irf8表达。

（3）JAK / STAT抑制剂托法替尼逆转了NPE细胞中IRF8的表达，但未逆转NPE-IE细胞中的IRF8的表达，这表明在NPE-IE细胞中，与JAK / STAT无关的机制正在发挥作用，以维持高Irf8表达。

（4）使用mCherry敲入报告基因表达Irf8，证实了IFNγ处理后可在NPE细胞中广泛诱导Irf8转录。

体外实验表明，Irf8对NPE细胞中的肿瘤相关巨噬细胞的响应很明显，在免疫逃避中起重要作用。

为了确定NPE-IE肿瘤TME内的免疫细胞类型，研究者从NPE肿瘤中分离免疫细胞，并在体外与亲代NPE细胞共培养。接下来研究人员生成了NPE-IE Irf8敲除细胞系。结果表明， Irf8的激活是NPE-IE细胞逃避免疫的重要因素，并且可能通过IFNγ介导的体内激活而发生。

七、人类GSCs显示出两种主要的转录亚型，而间充质GSCs是通过IFN信号来定义的

上述发现是否与人类疾病相关？为了回答这个问题，研究人员对GSC培养物进行了RNA-seq和分子亚型分析，使用非阴性基质因子分解来识别区分它们的关键转录元基因模块。结果表明（图7A-D）：

（1）通过分析体外扩增的GSCs，可以确定潜在的免疫诱导基因表达变化。

（2）确定了两种不同的亚型：S1，即非间充质免疫信号（non-MES^Imm）和S2，即间充质免疫信号（MES^Imm）。

（3）在富含MES^Imm的GSCs中观察到几个干扰素调节因子家族成员的上调，包括Irf 8和Irf 7；然而，Irf 1的关联更为显著。

（4）MES^Imm信号中CCL2的表达增加。在NPE细胞中这种MES^Imm信号的富集，随着细胞系获得免疫逃避能力（即NPE-IE细胞）而增加。

这证实了干扰素驱动的信号存在于间充质肿瘤患者体内。

八、人类MES^Imm GBM与NPE-IE细胞显示相似的DNA甲基化变化

为了评估富含MES^Imm模块的人类GBM是否也可能具有反映小鼠模型的DNA甲基化变化，研究人员在GBM患者的间充质亚型GBM干细胞中发现了相似的表观遗传和转录特征。综上所述，人类GBM也可能通过表观遗传免疫编辑来稳定这种免疫逃避状态，其机制与NPE-IE小鼠细胞中鉴定的机制相似。

讨论

在这篇文章中，通过将GBM干细胞（GSC）连续移植到具有免疫能力的宿主中，研究人员发现通过建立增强的免疫抑制肿瘤微环境可以使GSC获得免疫逃避能力。从机制上讲，这不是通过肿瘤亚克隆的遗传选择引起的，而是通过表观遗传学的免疫编辑过程完成的。关于巨噬细胞的募集，作用于免疫逃逸的机制，以及其他免疫细胞群的作用，还需要后续研究。总的来说，小编认为这是一篇参考价值极其高的文献！！建议收藏！！