大家好，今天给大家来聊聊“时空组学”那些事儿。2021年1月，时空组学被Nature Methods杂志列为2020年度技术，时空组学的出现被认为能带来生命科学领域第三次科技革命。今天给大家分享的文献是2022年1月份发表在Cancer Discovery（IF=39.39）上的一篇关于结直肠癌肝转移的时空组学文章。

Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level

结直肠癌肝转移的单细胞时空免疫图谱

摘要：肝转移是结直肠癌死亡的主要原因，表现出高度异质性和抑制性的免疫微环境。本文通过使用单细胞RNA测序和空间转录组学测定了97个配对样本。值得注意的是，转移性微环境对免疫抑制细胞（如MRC1⁺ CCL18⁺ M2样巨噬细胞）进行了显著的空间重编程。作者进一步开发了单细胞代谢组学，一种用于量化单细胞代谢的计算方法，并观察到这些巨噬细胞具有很强的代谢活性。有趣的是，新辅助化疗可以阻断这种状态并恢复有反应患者的抗肿瘤免疫平衡，而无反应患者则恶化为更具抑制性的患者。本文描述了转移的免疫进化，并揭示了肿瘤如何对新辅助化疗作出反应的黑匣子。

背景：

肝转移仍然是阻碍结直肠癌患者长期生存的主要原因，这也在一定程度上解释癌细胞高度动态的传播路径。在癌细胞中，肝转移的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）具有高度免疫抑制表型，诱导抗原特异性T淋巴细胞系统性损失，并驱动肿瘤扩散。目前仍不清楚免疫细胞是如何在空间上影响结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM）的进展和转移。因此，迫切需要记录、识别和量化CRLM的细胞甚至空间景观，以刷新对转移生物学的认识。

新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy, NAC）是指在肿瘤手术切除前使用化学药物。在CRLM中，NAC有明显出乎意料的结果。在一些报道中，NAC被证明可以延长无进展生存期和总生存期。然而，特别是在低风险可切除的CRLM患者中，NAC与总体生存期未改善相关。另一个独立研究报道NAC不能延长无病间隔时间。这些看似矛盾的数据提出了一个关键但尚未被充分理解的问题，即NAC是否有助于CRLM患者的抗肿瘤反应和改善预后。因此，准确剖析NAC的作用，特别是TME的改变，对于理解NAC的关键机制和设计新的治疗策略是至关重要的。

在这里，作者使用来自24例患者的97个样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics, ST），目的是探索CRLM的免疫图谱。作者发现：免疫微环境数据显示了从原发到转移部位的动态细胞和空间变化。NAC治疗后，反应性患者的免疫表型进行了抗肿瘤重塑，而非反应性患者的免疫表型则转向了更多的免疫抑制，免疫抑制细胞在转移位点被重新编程。作者的研究结果强调了高效NAC治疗可切除CRLM患者的良好效果，并允许数据驱动的新型治疗组合设计，例如在选定患者中采用NAC加免疫治疗。

方法：

1.样本：复旦大学中山医院结直肠癌肝转移样本。20名患者的89份样本进行sc-RNA，4名患者的8份样本进行空间转录组测序，27例患者的104份样本进行多重IHC（mIHC）分析。

2.scRNA-seq：10x Genomics，NovaSeq。

3.空间转录组：10x Genomics，ST测序。

结果：

1.整合scRNA-seq和空间转录组精确量化可切除结直肠癌肝转移样本的免疫细胞多样性

为了定义结直肠癌肝转移样本的单细胞图谱，作者使用结直肠癌、邻近结肠、肝转移和邻近肝脏、结肠淋巴结和外周血单个核细胞（PBMC）的配对样本，应用scRNA-seq和空间转录组来量化CD45⁺细胞动力学（图1A）。20名患者的89份样本进行了scRNA-seq，4名患者的8份样本进行了空间转录组测序，其中13名患者的54份样本未接受治疗，6名患者的30份样本接受了部分缓解（partial response, PR）的新辅助化疗，来自5名患者的13份样本接受了疾病进展或疾病稳定（progressive disease or stable disease, PD/SD）（图1A）的新辅助化疗。所有肿瘤都是微卫星稳定型。

作者从结直肠癌肝转移样本中鉴定出骨髓细胞、CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、NK细胞和B细胞（图1B、C）。值得注意的是，不同组织类型的T细胞比例明显不同，表明免疫微环境的组织异质性（图1D）。结直肠癌和配对肝转移均表现出调节性T细胞（Treg）约为10%，然而这种细胞在邻近的正常组织中是少见的，这表明存在被抑制的肿瘤内免疫，以前被认为是肝转移免疫治疗效果降低。同样作者整合了SingleR和基于手工标记的注释来进一步定义免疫细胞亚群（图1E）。同时，分析了来自两名未治疗患者和两名新辅助化疗部分反应（NAC-PR）患者（图1F、G）的8个样本（配对结直肠癌和肝转移）的空间转录组数据。无监督聚类分析将样品分类为不同的区域，例如肿瘤和成纤维细胞区域（图1F）。在未经处理的样本中，作者观察到与scRNA-seq一致的免疫细胞模式，例如CD8⁺ T细胞在肝转移和结直肠癌中显著富集（图1G）。相比之下，在新辅助化疗（NAC）处理的样本中，观察到较小的肿瘤区域和免疫细胞的不规则分布。特别是在肝转移中，只有一小部分斑点聚集成癌细胞，表明新辅助化疗治疗后细胞区室发生了根本性的重塑。总之，这些结果突出了结直肠癌肝转移患者的时空动态免疫细胞景观和新辅助化疗后的巨大重塑。

图1 scRNA-seq和空间转录组揭示了结直肠癌肝转移样本的免疫图谱

2.转移性肿瘤富含免疫抑制细胞，尤其是MRC1⁺ CCL18⁺ M2样巨噬细胞

考虑到患者的异质性细胞组成，作者使用算法来估计细胞比例，作者过滤了低丰度的免疫细胞，聚集免疫细胞群，并将其缩放在组织中（图2A）。一些免疫抑制细胞特异性地存在于肝转移中，其中观察到SPP1⁺巨噬细胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞急剧增加（图2B）。中性粒细胞作为潜在的促瘤参与者也在肝转移中富集（图2B）。同样，MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞和SPP1⁺巨噬细胞在未经治疗的肝转移中富集（图2C）。这些数据与scRNA-seq数据一致，进一步证实了肝转移中潜在的抑制性TME。接下来试图在另外三个独立的结直肠癌肝转移人群中验证这一发现。首先，作者使用mIHC来量化同一医院另外27名结直肠癌肝转移患者中选定免疫细胞亚群的空间分布（图2D-F）。在未处理的样本中，作者观察到FOXP3⁺ Tregs、MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞和SPP1⁺巨噬细胞在结直肠癌和肝转移中浸润显著增加，这与scRNA-seq数据基本一致（图2F）。作者探讨了TCGA中结直肠癌人群中scRNA-seq定义的免疫细胞亚群的预后价值，发现原发性肿瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞和SPP1⁺巨噬细胞的高分都预示着预后更差（图2G）。这些结果还使作者假设：特定的巨噬细胞亚群可能在结直肠癌肝转移前肿瘤生态位形成中起根本作用。

图2 从原发肿瘤到肝转移的免疫重塑，尤其是MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞

3.转移性肿瘤的巨噬细胞可能受到抑制

鉴于肝转移中巨噬细胞亚群的富集，作者假设这些肝转移富集的巨噬细胞在不同组织中可能在功能上是不同的。因此，作者进行了基于配体-受体的肿瘤-免疫交叉分析，并比较了原发部位和转移部位（图3A），引人注目的是，SPP1⁺巨噬细胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞在肝转移和结直肠癌之间的所有差异交叉细胞类型中排名靠前。该结果表明肝转移癌细胞可能优先重编程巨噬细胞并诱导其特定的功能状态（图3A）。值得注意的是，肝转移中的转移性肿瘤细胞优先表达配体CD47，因此可能会通过相应的受体SIRPA募集或激活MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞（图3B）。作者进一步利用mIHC来可视化这些蛋白质并直接观察CD47⁺肿瘤细胞和SIRPA⁺巨噬细胞之间的交叉（图3C）。这些特异性富集于肝转移的配体-受体对为靶向治疗肝转移提供了线索。

为了确定独特的TME差异，作者在结直肠癌和肝转移巨噬细胞之间进行了差异基因表达分析。值得注意的是，肝转移富集的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞高度表达巨噬细胞极化的关键分子（图3D）。APOE作为一种抗炎和前M2转换蛋白，是显著差异表达的基因之一。其他M2极化相关基因如MARCO在肝转移富集的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞中也显著上调（图3E）。相比之下，作者发现富含结直肠癌的MRC1⁺CCL18⁺巨噬细胞表现出更高的炎性细胞因子，包括TNF、IL1B、CCL3和CCL4。在SPP1⁺巨噬细胞中也观察到这种分子谱的变化，表明巨噬细胞具有从原发性到转移性的共同功能变化。通路富集分析显示（图3F）来自结直肠癌和肝转移的MRC1⁺ CCL18巨噬细胞代谢途径明显富集，这也突出了代谢在确定这些巨噬细胞功能中的基本作用。值得注意的是，作者发现结直肠癌中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞富含氧化磷酸化，而它们在肝转移中的对应物则以氨基酸代谢为主。这些数据强调了代谢调节可能介导巨噬细胞响应不同的微环境表型和功能转变。

图3 转移性肿瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞表现为终末分化和抑制状态

4.MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞在肝转移中的代谢活性急剧增加

在单细胞分辨率下挖掘代谢活动仍具有挑战性，主要是因为缺乏易于使用的计算方法。作者在本文中提出了单细胞代谢R包，它由三个连续步骤组成（图4A）。为了了解结直肠癌肝转移中骨髓细胞的代谢情况，作者首先计算了抑制性巨噬细胞和单核细胞所有76种活跃代谢途径的评分。其中，作者选择前50%的可变代谢评分，并根据其平均代谢评分对骨髓细胞进行排序（图4B）。引人注意的是，肝转移-浸润性的MRC1+ CCL18+巨噬细胞在所有骨髓细胞中表现出最高的代谢活性，表明它们非常有活力，这可能与其在转移部位的独特功能有关。MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞的所有代谢相关基因无监督聚类观察到与周围组织相关的强代谢偏好（图4C），确定了在结直肠癌和肝转移中可能上调的42种代谢途径-浸润的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞。随后仔细研究差异表达代谢基因，并发现在原发性和转移性浸润的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞中特异性上调的代谢基因，部分是已知药物的靶基因（图4C）。GSTO1是一种通过细胞色素P450代谢异生物质的酶，在结直肠癌和肝转移样本中浸润MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞中显著升高，并与分化相关。IL4I1和MIF是巨噬细胞活化所必需的基因，也显示出相似特征（图4D、E）。接下来为了确定巨噬细胞的这种高度代谢激活状态是否在物种间是保守的，作者构建结直肠癌肝转移的小鼠模型（图4G）。结果，在小鼠结直肠癌肝转移模型中发现了类似的巨噬细胞亚群，例如MRC1⁺巨噬细胞和Spp1⁺巨噬细胞（图4H）。进一步代谢量化显示富含肝转移和结直肠癌浸润巨噬细胞的特征代谢状态（图4I）。为了说明代谢重编程与巨噬细胞表型变化的关联，作者计算了巨噬细胞的经典表型评分，例如抗原加工和呈递、炎症、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白细胞介素信号通路和补体。事实上，在肝转移中，MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞的抗原加工呈递和补体活性得分显著增加（图4J）。有趣的是，几种巨噬细胞特异性代谢途径，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，在肝转移中显示出与抗原加工呈递的强相关性，但在结直肠癌中表现出弱相关性（图4K）。这些数据共同暗示了在决定MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞表型上潜在的代谢作用。

图4 转移性肿瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞表现出较高的代谢活性

5.新辅助化疗-响应和非响应肿瘤拥有不同的免疫动力学，尤其是在宏观上

为了探讨NAC对抗肿瘤免疫的影响，作者对所有CD45⁺细胞进行聚类分析。有趣的是，作者观察到在结直肠癌和肝转移之间细胞聚集的明显不同（图5A）。为了了解哪种类型的细胞改变，作者计算了细胞成分并做了差异分析（图5B、C）。值得注意的是，新辅助化疗对TME的影响呈现高度细胞类型特异性和相互关联性（图5B、C）。在部分反应的肿瘤中，新辅助化疗能下调免疫抑制性细胞和细胞毒性细胞（图5B）。在肝转移中，响应性新辅助化疗下调SPP1+巨噬细胞但上调细胞毒性T细胞（如GZMK⁺ CD8⁺ T细胞、XCL1⁺ CD8⁺ T细胞）（图5B、D）。在肝转移中SPP1⁺巨噬细胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞浸润增加，而细胞毒性免疫细胞（FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T细胞）浸润下降（图5C、E、F）。总之结果表明，有效的新辅助化疗不仅能重新编程肿瘤内免疫平衡，还能激活全身抗肿瘤免疫反应，为新辅助化疗在可切除结直肠癌肝转移中的潜在应用提供了证据。

图5 新辅助化疗通过激活细胞毒性免疫细胞和抑制转移性肿瘤的免疫抑制细胞来恢复免疫平衡

6.在反应性肿瘤中新辅助化疗诱导巨噬细胞代谢重编程

考虑到新辅助化疗主要影响髓系群尤其是巨噬细胞，因此作者想探究巨噬细胞的轨迹是否被新辅助化疗重编程。作者把骨髓细胞根据新辅助化疗治疗反应确定了髓系细胞分布，并确定了PD/SD和PR样本之间的髓系表型丰富性。在未处理样本中，作者观察到髓样细胞的发育轨迹，而PR组髓样细胞富含单核细胞表型，表明其早期分化状态（图6A）。细胞比例差异分析证实了在NAC-PR肿瘤中巨噬细胞的终末状态缺失，如MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞和SPP1⁺巨噬细胞显著下调（图6B）。相比之下，与未接受治疗的肿瘤相比，NAC-PD/SD肿瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞和SPP1⁺巨噬细胞水平显著升高（图6B）。接下来，作者利用mIHC在另一些人群中检查这些巨噬细胞（图6C），证实MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞浸润和SPP1⁺巨噬细胞在NAC-PR肝转移中浸润较少（图6D）。轨迹推断分析进一步明确了S100A9⁺单核细胞向MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞的发育轨迹，表明未治疗组与NAC-PR组的极化相反（图6E）。结果表明，化疗阻断巨噬细胞的轨迹只存在于反应性肿瘤中。

鉴于转移性肿瘤中MRC1⁺ CCL18⁺和SPP1⁺巨噬细胞数量有限，作者对未处理和新辅助化疗处理的样本中所有髓系细胞进行了通路富集分析，发现在PR和PD/SD组中新辅助化疗诱导髓系细胞特异性功能改变（图6F）。PR组肝转移巨噬细胞表现出核糖体富集的基因特征，而PD/SD组与补体和凝血级联相关。单细胞代谢途径分析表明新辅助化疗显著阻断髓系代谢，PR组代谢显著下调（图6G）。总之，新辅助化疗可引起髓系特异性代谢重编程，这可能有助于大家对新辅助化疗诱导的抗肿瘤机制的理解，并为可切除的结直肠癌肝转移患者提供潜在的治疗方法。

图6 新辅助化疗治疗样本中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞的代谢重编程

7.多转移灶免疫微环境呈高度多样化

为了特异性捕获转移间免疫异质性，作者对4例肝转移多转移灶患者的所有CD45⁺细胞进行无监督聚类。有趣的是，多转移灶表现出明显不同的免疫图谱（图7A）。对于未治疗的患者（P10），肝转移位点2在相邻肝脏的同一簇中，而肝转移位点1与其他样本不相似。另外3例新辅助化疗的多灶性肝转移酶也具有转移间异质的免疫特征。未治疗组和肝转移位点中细胞成分中的免疫抑制性细胞浸润明显有差异，而肝转移患者P10中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞浸润有显著差异（图7B）。如此显著的转移间异质性可能导致对化疗和其他治疗的不同反应，这在临床实践中得到了充分证明。

图7 多发转移灶的异质性免疫微环境

结论：

作者提出了结直肠肝转移的单细胞空间图谱，并在转移部位发现了高度代谢激活的 MRC1⁺ CCL18⁺ M2样巨噬细胞，有效的新辅助化疗可以减缓这种代谢激活，提高靶向转移代谢途径的可能性。

参考文献：Wu Y, Yang S, Ma J, et al. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level[J]. Cancer Discov, 2022, 12 (1):134-153. DOI:10.1158/2159-8290.CD-21-0316.