DNA methylation loss promotes immune evasion of tumours with high mutation and copy number load

DNA甲基化缺失促进具有高突变和拷贝数负荷肿瘤的免疫逃避

细胞有丝分裂增加肿瘤突变负荷和拷贝数负荷是免疫疗法临床受益的预测标志。研究发现免疫调节通路基因集中在后期复制部分甲基化域中，并在具有CpG岛启动子高甲基化的去甲基化肿瘤中被转录抑制。全局甲基化缺失与免疫逃避特征相关，与突变负荷和非整倍性无关。研究对各种肿瘤类型的TCGA数据进行了大规模的系统分析，研究了全局甲基化水平与细胞增殖，突变负荷，SCNA水平，浸润性免疫细胞标记和免疫应答基因活性之间的关系。使用肺癌队列测试了由分子分析得出的假设，这是第一项针对癌症免疫疗法的分子和临床数据中的DNA甲基化模式的研究。结果表明作为免疫治疗中重要的预测标志物，基因组去甲基化与表观遗传调控有关，可以作为精确免疫治疗的联合方案。

结果

全局甲基化与免疫特征相关

对TCGA数据进行的泛癌分析表明，细胞增殖的标志物与癌症类型之间的突变负荷和非整倍性紧密相关。基于核素-1探针的基因组去甲基化方法也与细胞增殖标记物（图1a）密切相关。甲基化缺失还与突变负荷（图1b）和染色体SCNA负荷（图1c）的增加有关。研究发现了全局L1甲基化水平与免疫标记之间的相关性（图1d）。基于样本水平特征，对每个基因的表达水平进行了多元回归分析，可以确定在调整纯度，年龄和肿瘤分期时，免疫浸润与全局甲基化水平相关，而与突变负荷和非整倍性无关（图2a）。还观察到与基因组去甲基化的显著相关性应当包括在肿瘤细胞中表达的基因的免疫调节通路（图2b）。细胞增殖标志物的相关性与免疫调节基因的相关性相反（图2b）。

图1全局DNA甲基化水平的相关性

图2基因组甲基化缺失与免疫逃避特征相关

晚期复制区域免疫基因的抑制

通过细胞系数据，确定了与正常细胞相比在癌症中更早或更晚复制的基因。结果发现在癌症晚期复制的基因在具有CpG岛（CGI）启动子高度甲基化的去甲基化肿瘤中被显著抑制（图3a，b），早期复制的基因在去甲基化的肿瘤中倾向于过度表达（图3c）。免疫相关通路在晚期复制区域中过度表达，而细胞周期基因则集中在早期复制区域中（图3d）。癌症中晚期复制基因富集通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用，干扰素-α/β（IFN-α/β）信号传导和RIG-1 / MDA5介导的IFN-α/β诱导（图3e）。与肿瘤内去甲基化获得的数据相反，甲基化抑制剂的治疗显示可诱导内源性逆转录病毒（ERV）和LINEs衍生的双链RNA，从而导致癌症中IFN-α/β反应的激活。测量肿瘤样品中ERV和L1的表达水平，它们的表达水平与细胞毒性免疫活性指标的相关性通常是阴性的，这表明IFN-α/β沉默通过基因组去甲基化作用覆盖了ERV / L1表达的免疫刺激作用。

图3晚期复制区的基因特征

部分甲基化域中免疫基因的抑制

晚期复制区的甲基化缺失与称为部分甲基化结构域（PMD）的异色结构形成有关，有研究表明，PMD去甲基化是多种癌症类型的共同特征。各种类型癌症中PMDs中的基因在很大程度上由于抑制性染色质结构的形成或CGI甲基化过高而被沉默。PMD的甲基化变异性和复制时机导致了三个截然不同的亚类（图4a）。PMD的特性与其基因组长度相关，而较短的PMD复制时机较早（图4a，b）。涉及抗原加工和呈递，细胞因子-细胞因子受体相互作用以及JAK-STAT信号传导通路的免疫调节通路基因集中在短PMD中（图4c，d）。INF-α家族基因在短PMD中（图4e）。在短PMD内有8个HLA基因，与晚期复制区域（图3a，b）一致，短PMD在去甲基肿瘤中伴有基因抑制（图4f）和CGI高甲基化（图4g）。富集的免疫基因（图4c，d）显著集中在PMD边界附近（图4h），这表明这些基因特别容易启动子甲基化。

图4部分甲基化域中的基因表征

全局甲基化预测对免疫疗法的反应

从肺癌抗PD-1 / PD-L1队列中的60个样本中生成了甲基化组和外显子组数据，并组成由81个甲基化组和22个外显子组的抗PD-1肺癌队列。为了进行验证，利用了40位接受免疫疗法的TCGA黑色素瘤患者的数据，图5a提供了这三个队列的信息。根据L1甲基化水平，将合并后的肺癌队列的样本分为低甲基化组与高甲基化组。低甲基化人群表现出降低的基因组甲基化和增加的CGI 甲基化（图5b，c）。与泛癌分子数据分析一致，全局低甲基化样本在短PMD中显示出高突变负荷和非整倍性以及CGI超甲基化（图5d）。SMC和TCGA队列的转录组数据表明，参与这两个队列的全局去甲基化肿瘤的MHC和细胞因子-细胞因子受体相互作用的基因显著富集，可用于抑制这两个队列的全局去甲基化肿瘤。当根据L1甲基化水平对患者样本进行分层时，低甲基化组的预后较差（图5e-g）。对于合并的肺癌队列，共获得82个样本的甲基化组和匹配的外显子组数据（图5a）。与全局L1甲基化水平相比，突变负荷未能显示出显著结果（图5h）。以生存为反应变量的多元回归显示，全局L1甲基化水平具有显著影响，但P = 0.05时无突变负荷（图5h）。分别重复两个肺癌队列的单变量比较，SMC队列和IDIBELL队列均通过全局甲基化导致显著分层，但未因突变负荷而显著分层（图5g，i），全局L1甲基化水平与非整倍性负相关（图5d）。泛癌分析发现，非整倍性与免疫逃避的特征有关。总之，低甲基化和高非整倍性都有望降低肿瘤免疫力并破坏免疫疗法的临床受益。当检查可获得非整倍性数据的SMC肺癌队列时（图5a），只有全局甲基化显示出不良的临床反应之间的显著相关性（图5g）。TCGA黑色素瘤队列重复此试验，根据L1甲基化水平将样品分为低甲基化组与高甲基化组，黑色素瘤中的低甲基化基团在短PMD中概括了CGI启动子的甲基化，并且对免疫疗法的反应预后较差。突变负荷和非整倍性水平均不能解释临床受益。

图5基因组去甲基化对检查点阻断的临床受益产生不利影响

全局去甲基化排除了非整倍性的影响

全局去甲基化与不同肿瘤类型的SCNA显著相关（图6a），结合染色体SCNA和臂SCNA水平确定了染色体SCNAs（cSCNAs）的大小，并将此结果与焦点SCNAs（fSCNAs）进行了比较，cSCNA比fSCNA的相关性更强（图6b）。使用偏相关来估计控制fSCNA（或cSCNA）时，L1甲基化水平与cSCNA（或fSCNA）相关的程度。在大多数情况下，全局低甲基化与cSCNA相关，而与fSCNA无关（图6c）。当控制了cSCNA时，与fSCNA的相关性就消失了（图6c）。免疫特征评分的多元回归分析显示，全局L1甲基化水平明显高于cSCNA水平（图6d）。对免疫特征评分，全局L1甲基化水平和cSCNA水平进行偏相关分析。控制cSCNA水平后，免疫特征评分与全局L1甲基化水平之间存在正相关关系（图6e）。这些结果表明高度非整倍性肿瘤的免疫逃避特征与基因组去甲基化有关。

图6非整倍性表明全局DNA低甲基化

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