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现在我们已经进入单细胞数据的时代了，而大家最关心的应该是和自己科室相关的话题了。不同临床科室面对的科学问题千差万别。毫无疑问，在各个科室要开展单细胞课题，需要结合文献案例来付出更多的时间来参悟， 在这里我以人体八大系统为基础并结合案例来看一看单细胞课题在各类科室如何展开~
目录（上）
一、单细胞优势及开展流程
二、心血管科
三、呼吸科
四、运动关节科
五、神经科
一、单细胞优势及开展流程
使用传统的基因表达分析技术，如定量PCR、微阵列、RNA测序，但是这些测量很有可能产生误差，尤其是在具有高度异质性的不同细胞类型。当然在对细胞膜蛋白标记定义的多种细胞类型的样本进行分析时，也可以首先使用荧光或磁珠辅助的方法对靶细胞群体进行分类，并单独进行分析，但这样费钱啊~ 而且不能完全辨别细胞异质性的全谱。因为一个细胞群体往往是异质性的。比如你想研究某个细胞群的基因表达状态，想测它的mRNA，看表达谱。问题是，细胞群不可能都有相同的基因变异，而且不太可能都处于相同的状态（不如细胞周期、分化状态等）。那么用传统方法去测，弄出来的数据不能精细代表每一簇细胞，一些稀有的亚型的特征或者比较重要的状态就会被抹平。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的出现，通过高分辨率和深度分析样本中的每个细胞的转录组，解决了这一局限。scRNA-seq能够非常高的分辨率和准确性对细胞异质性进行评估，识别新的细胞状态和群体，并阐明发育和分化过程中的动态细胞转变。由于这些原因，scRNA-seq技术对各个研究领域产生了深远影响。如癌症，发育，进化，免疫等领域单细胞都是解析异质性的一大利器。
下面我介绍一下单细胞测序的工作流程
单细胞RNA测序的一般实验工作流程始于将感兴趣的器官或组织解离为活的单细胞，这需要一个微小的消化方案，使细胞数量和细胞质量最大化，同时将消化持续时间和细胞死亡降至最低。培养的细胞同样被分离并制备成单个细胞。然后，通过各种单细胞捕获方法捕获准备好的细胞。对单细胞RNA进行逆转录，然后进行PCR扩增和文库制备。随后进行下一代测序以产生读数，这些读数与参考基因组对齐，处理以进行质量控制，最后进行分析。
二、心血管科 · 单细胞
心脏异常和疾病对人类健康的无情威胁促使人们寻求对心脏的新知识。细胞异质性成为心脏生理学和病理学机制研究中的一个主要焦点。成人心脏的细胞复杂性还有很多未知之处。最近的研究解释了某些细胞类型在心脏生理学和疾病中的功能。例如，巨噬细胞(MPS)被发现可以促进电传导，并在小鼠心脏衰老和心肌梗死中发挥重要作用。人类心脏细胞图谱中仍然缺乏，这可能是与人类心脏组织的可获得性有限有关。在这里我介绍一篇人类心脏组织的单细胞测序相关的文章。
文献案例：《单细胞重建成人心力衰竭和恢复期间的细胞图谱》[2]
这篇文章发表在期刊: Nature Cell Biology，这本期刊在最近一年的影响因子为 28.824。中科院大类: 生物学 1区 中科院小类: 1区 细胞生物学。
结果解读：
作者使用了两种分离方法：富含CM-enriched消化法和regular消化法，前者产生高质量和高纯度的CMs，后者最适合剩下的心肌细胞类型。优化的CM分离方法获得了典型的杆状形态、高活力、清晰的条纹和具有CM标记α-Actinin2的细胞。为了全面了解正常成人心脏的细胞组成，作者使用无监督聚类t-SNE对细胞进行划分，并根据其各自的分子特征将整个群体分为5种主要细胞类型，包括心肌细胞（CMs）、内皮细胞(ECs)、成纤维细胞(FBS)、巨噬细胞（MPs）和平滑肌细胞（SMCs）。
为了深入了解心房（A）和心室CMs（V）之间的分子差异，作者应用非监督聚类对t-SNE识别的所有3894个CMs进行了划分。心房和心室CMs各形成五个不同的亚群(LA1-5和LV1-5)；房室群(LA和LV中都有的细胞)是唯一的例外。免疫组织化学染色证实LA CM亚簇(LA1和LA2)和LV CM亚簇(LV1和LV3)的存在。接下来，作者检查了LV CMs、LA CMs和AV共享CMs中的DEGs。虽然LA CMs和LV CMs都表现出独特的表达模式，反映了它们的功能，但AV CMs没有表现出显著的功能富集。LA CMs和LV CMs对肌肉收缩的影响最大，然而，收缩相关基因的表达谱在这两个compartment之间是不同的。LV CMs在代谢过程中表现出显著的富集。相比之下，LA CMs更多的参与在细胞信号和通讯、发育和免疫过程中。
由于NCMs已知在心脏内稳态和紊乱中起关键作用，作者试图确定其在成人心脏中的组成。通过t-SNE将ECs、FBS、MPS和SMC分别划分为4、3、3和4个亚簇。亚簇相对均匀地分布在LA和LV之间。GO分析表明，EC亚簇3(EC3)富集到与核糖体生物发生、细胞因子产生和趋化因子分泌相关的功能，而EC4与免疫应答、细胞-基质粘附和细胞连接组装相关。通用EC标记PECAM1与EC3标记ACKR1的共同定位证实了该EC亚型的存在。此外，MP2与免疫反应高度相关，而MP3则参与电偶联。FB1和SMC1都与细胞外基质组织有关，这表明在成人心脏中这两种细胞类型之间存在功能重叠。FB1与LA中其他细胞类型的相互作用频率最高，而EC3(ACKR1+)在左心室中的频率最高，这表明这些亚型利用不同的细胞相互作用网络和细胞中枢来维持体内平衡。
小编总结：
作者在LA和LV中发现了意想不到的CM多样性，其特征是在每个亚型中优先表达细胞表面标记、分泌蛋白、细胞骨架基因和转录因子。不同的亚群也表达了一组不同的与收缩和代谢相关的基因，这表明这些亚群在维持心脏功能方面具有不同的作用。在今后的研究中，系统地确定CM和NCM亚簇在生理和疾病中的空间定位和功能将是非常重要的。
三、呼吸科 · 单细胞
肺是呼吸系统中最常见的器官，肺发育是一个复杂而微妙的过程，由多达40种细胞类型的空间和协调的促进发育形成。肺细胞系的发育起源和异质性一直是几十年来研究的焦点。然而，由于肺组织存在复杂性和异质性，研究单个细胞类型中基因表达的细微变化时非常困难。快速发展的单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术能够对生物过程中的复杂细胞动力学进行观察。
文献案例：《单细胞RNA测序显示早期肺腺癌（携带EGFR突变）异质性肿瘤和免疫细胞群》[3]
这篇文章发表在期刊: Oncogene，在最近一年的影响因子: 9.867，中科院大类: 医学 1区
中科院小类: 1区 生化与分子生物学。
结果解读：
经10×Genomics单细胞3’rna文库构建和测序后，从组织中制备单细胞悬液，构建scrna-seq文库。作者对所有7个肿瘤样本和5个匹配的肺组织的单细胞进行了无监督的聚类，并用UMAP对其进行可视化处理，检索到32个不同的簇。为了鉴定不同的细胞类型，作者分析了典型标记在每个簇中的表达以及差异表达基因的富集。这样就可以将这些细胞群分为肿瘤细胞、支气管/肺泡上皮细胞、髓样细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、癌相关成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞。
由于免疫成分可以对肿瘤的发生和发展起到至关重要的影响，作者研究了LUAD早期样本中免疫浸润的特征。作者将所有的髓系细胞分成14个不同的亚群，发现大多数(~90%)的髓系细胞是表达CD68的巨噬细胞。与正常组织中的巨噬细胞相比，TAMs高表达APOE和SPP1。TAMs中富集的DEGs与细胞外基质分解、低氧反应、正向调节胆固醇外流以及对肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素1B(IL1B)的反应等途径有关。然后作者用抗CD68和抗Ki67抗体通过免疫组化证实了这些增殖性巨噬细胞的存在。为了了解LUAD早期TAMs的极化，作者检测了传统的经典活化巨噬细胞(M1)和替代活化巨噬细胞(M2)特征基因在这些簇中的表达。肿瘤组织和正常肺组织的巨噬细胞均未表现出特异性的M1或M2特征。但是，它们具有M1和M2签名基因的类似表达水平。虽然早期LUAD中的TAMs似乎表达促进肿瘤发生的基因，但它们还没有明显的M1和M2极化。
所有T细胞的无偏聚类在肿瘤样本和正常组织之间没有显示任何不同的T细胞簇，所以作者决定检查每个簇中T细胞亚型标记的表达。作者发现，肿瘤浸润的T细胞高表达调节性和耗竭性标志物，如TIGIT、LAYN、FOXP3和CTLA4，而正常组织中的T细胞高表达效应性和幼稚T细胞标志物。作者还鉴定了增殖性T细胞亚型，它既表现出效应性T细胞的特征，又表现出功能障碍的标志。
拷贝数量变化CNV异常的细胞被鉴定为恶性细胞。在功能富集分析的基础上，进一步将其划分为8簇。这些簇分别富含低氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻译起始、细胞周期和抗原提呈等途径。由于肿瘤细胞同时高表达近端和远端上皮祖细胞标志物，肿瘤细胞由不同细胞系表达谱的异质群体组成。
小编总结：
利用scRNA-seq技术(10×Genomics)，作者同时、全面地分析了肿瘤标本中不同的细胞亚群。并且鉴定了不同的肿瘤细胞亚群及其TME成分，表明LUAD在肿瘤发生的早期就已经出现了异质性。这项工作为了解亚洲患者中携带EGFR突变的早期LUAD患者的异质性和免疫细胞图谱提供了有价值的资源。
四、运动关节科 · 单细胞
在运动系统中，其典型的代表之一为骨骼肌细胞，下面我将从骨骼肌细胞的角度讲述在运动系统单细胞测序如何开展。在生理条件下，成人骨骼肌的细胞循环率相对较低。骨骼肌是运动、体温和新陈代谢的重要组织。它也是哺乳动物中发现的最具再生能力的组织之一，能够在各种创伤和病理条件下再生。虽然卫星细胞(SCs)是损伤后肌纤维再生的主要参与者，但成功的肌肉愈合需要其他细胞类型的参与，这些细胞类型直接或间接地促进了这一过程。在这种情况下，免疫细胞和纤维/成脂前体细胞在清除损伤组织的方面起着重要的作用，同时也帮助干细胞发挥其再生的作用。在过去的几十年里，人们对肌肉再生过程中发生的复杂细胞交互进行了详细的研究。然而，到目前为止，大多数研究主要依赖于通过少数几个特异性标志物的表达来鉴定大量细胞群体，并分类进行体外分析。因此，由于缺乏合适的技术来解决这个问题，人们对肌肉细胞群体的异质性知之甚少。直到最近，确定单细胞转录组的技术的发展才得以揭示这种异质性的程度及其在肌肉生理学和病理学上的可能意义。
文献案例：《骨骼肌再生过程中细胞群动态的高维单细胞定量分析》[4]
这篇文章发表在期刊: Cells，在最近一年的影响因子: 6.6，中科院大类: 生物学 3区
中科院小类: 3区 细胞生物学。
结果解读：
wt：野生型模型 mdx model：肌营养不良症小鼠模型
作者试图确定两种小鼠模型中不同的单个核细胞群体的特征，并监测细胞群体在再生过程中的丰度变化。在wt肌肉中，分离的单个核细胞数量在损伤后增加，在第3天达到峰值，第10天恢复到接近基线水平。相反，与组织学分析中观察到的mdx肌肉的弹性一致，mdx小鼠受损的肌肉中没有检测到这种反应，在整个再生过程中，mdx小鼠的单个核细胞数量保持不变。
应用Cytofkit中t-SNE算法，对单细胞数据进行了降维处理，图2A中14个抗原的读数被用作t-SNE算法的输入。这种方法产生了wt骨骼肌中单个核细胞群体抗原表达谱的二维图，并导致识别出15个不同的细胞簇。通过将15个已识别的簇的表达谱与文献中描述的细胞类型的表达谱进行匹配，将其进一步分组为8种细胞类型。巨噬细胞、肌源性祖细胞(MPS)、纤维/成脂前体细胞(FAP)、内皮祖细胞、外周细胞样细胞、间充质样细胞，剩余的三个非丰富簇的表达谱不能与已经描述的任何肌肉细胞类型匹配，因此被归为“其他”。当作者分析不同时间点的样品时，还可以监测CTX损伤（肌肉损伤）后细胞数量的动态变化。事实上，图2C中的情况并不是一成不变的，因为不同细胞群体的相对丰度在再生过程中发生了变化。通过比较不同时间点的二维t-SNE图可以更好地理解这些。在这里，用与细胞密度有关的颜色，从蓝色(低密度)到红色(高密度)，以了解再生过程中细胞群体比例的显著变化。
在动态肌修复中，大约60%的单个核细胞暴露了CD45抗原。这个细胞隔室在受损后数量增加，在第1天和第3天达到高峰。在生理条件下，一小部分造血细胞也表达F4/80+抗原，这是一种泛巨噬细胞标志物。肌源性祖细胞(MPS)和纤维/成脂祖细胞(FAPs)未表达CD45抗原。作者的单细胞分析显示，从第3天到第10天，两种细胞类型的数量都翻了一倍以上。FAP群随着再生过程的进展而变得更多，在CTX损伤后5-10天达到最大扩张，并在第20天恢复到几乎对照组的水平，CD31簇4被认为是肌内皮细胞亚群，包含高水平表达α7整合素抗原的细胞。总体而言，内皮细胞在损伤后的最初几天，它们的数量明显减少，然后在再生过程接近尾声时，超过了体内平衡水平。外周细胞样这一群体的丰度遵循一个受再生过程控制的动力学规律，而且与经典内皮细胞的情况也非常相似。
作者进一步的目的是描述mdx营养不良肌肉对急性损伤的反应和随后的再生过程。从mdx小鼠未损伤和ctx损伤的骨骼肌中分离单个核细胞，步骤描述的wt相同。然而，通过比较不同簇中的抗原表达谱，作者将每个簇与一种主要的肌肉单个核细胞类型相关联，并将其与wt中观察到的相匹配。正如在损伤后恢复的wt肌肉中观察到的那样，在mdx模型中，不同细胞群的相对数量在损伤后和再生过程中也发生了变化。
作为一个整体，CD45+隔室中的细胞数量在再生过程中没有明显变化，然而，细胞在隔室内的不同种群中的分布是高度动态的。在急性损伤前，mdx肌肉中已有大量的巨噬细胞，在wt模型中观察到，ctx治疗后早期显著增加，在第20天恢复到mdx基线水平，约占单个核细胞总数的30%。另一方面，M2巨噬细胞在损伤后早期保持不变，直到再生过程后期才增加。虽然MAP的数量在急性损伤后的第一天就下降了，并在随后的时间恢复到未受干扰的水平，但在整个再生过程中，FAP保持在一个恒定的高水平。内皮祖细胞的cd31表达细胞，数量首先下降了大约三倍，在再生过程的后期才恢复。这与在wt中观察到的情况不同。外周细胞样群也表现相似，在损伤后立即数量下降，然后缓慢恢复，但在第20天没有达到完全恢复。
小编总结：
骨骼肌在受损时具有惊人的自我修复能力。通过应用降维技术，如t-SNE算法，作者生成了二维地图，提供了对重建过程的可视化描述。并在单细胞水平上描述了野生型(wt)和肌营养不良(mdx)小鼠模型急性损伤后肌肉单个核细胞数量的动态。通过检测wt或mdx小鼠注射毒素后1、3、5、10和20天的肌肉单个核细胞样本来监测再生过程。
五、神经科 · 单细胞
神经损伤可能导致神经病理性疼痛，神经病理性疼痛严重影响患者的生活质量。周围神经损伤可诱导一系列的细胞和分子反应，包括基因调控、轴突变性、卫星胶质细胞和Schwann细胞的激活、炎细胞浸润等。损伤背根神经节基因表达谱的动态调节已被广泛研究，并可能是神经病理性疼痛的重要触发因素。单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种检测单个细胞转录组的强大技术。scRNA-seq被应用于体感神经元的异质性检测和背根节（DRG）神经元类型的鉴定。分析scRNA-seq数据的算法揭示了复杂生物过程中单细胞基因表达的动力学。因此，scRNA-seq可以为我们提供对神经病理性疼痛的动态进展的更深层次的洞察力。
案例解读：《体感神经元的单细胞转录分析揭示神经病理性疼痛的时间发展》[5]
这篇文章发表在期刊: Cell Research，在最近一年的影响因子: 25.617，中科院大类: 生物学 1区 中科院小类: 1区 细胞生物学。
结果解读：
作者打算确定成年小鼠在神经病理性疼痛条件下背根神经节神经元的单细胞转录。啮齿类动物受到单侧SNI（保留性神经损伤），可引起明显而持久的机械性痛觉超敏。作者在SNI后6小时、24小时、2天(2天)、7天和14天的不同时间点对分离自同侧L4和L5背根节的细胞进行10x Genomics scRNA-seq。DRG细胞可分为9种主要类型，具有不同的分子标记。
为了探索正常和神经病理性疼痛条件下DRG神经元的异质性，作者根据其转录特征对DRG神经元进行了重新分类。两个对照样本的神经元在t-SNE图上均匀分布。用不同的分子标记对19个神经元簇进行了无偏鉴定。代表性基因被用来注释这些簇。
作者使用Seurat通过10×Genomics将来自对照组和SNI组 14d的数据与使用Smart-seq2技术的数据进行集成。结果，作者确定了18个簇，在所有神经元类型中，Smart-seq2检测到的基因数量都多于10×Genomics学检测到的基因数量，然后，作者将18个簇与之前的报告进行了匹配，大多数簇与之前的结果是一致的。作者的数据显示，PROKR2在~1.7%的DRG神经元中表达，而Smr2在~1.6%的DRG神经元中表达。RNAScope分析表明，Cldn9与Zcchc12在DRG神经元中没有共表达。DCN几乎只在神经元胞体外表达，而只有~1%的DRG神经元表达DCN。Rxfp1在~1%的DRG神经元中特异性表达，而在其他细胞中不表达。DCN和Rxfp1在DRG神经元中的表达与Zcchc12的表达一致。因此，用10×Genomics scRNA-seq鉴定了稀有的DRG神经元簇。
为了研究SNI诱导的新生神经元类型的发育和进展，作者将t-SNE图按时间点拆分。1-16簇的神经元在各时间点均呈均匀分布。SNI之后出现了三个新的簇，命名为SNIIC1-3。SNIIC可能在SNI后很长一段时间内消失。在这三个SNI诱导的神经元簇中鉴定出数百个DEGs。用双荧光ISH结果验证，在SNI24h和SNI2d，ATF3和Gfra3在~5%的DRG神经元中共表达，在SNI 2d时，ATF3和Gfra3在~12%的DRG神经元中共表达。此外，SNIIC1和SNIIC3也用Gal（一种有助于轴突再生和调节神经病理性疼痛的神经肽）标记。因此，作者的数据表明SNIIC2神经元只是暂时存在的。
小编总结：
最近，10×Genomics scRNA-seq已被应用于定义神经元规范的转录调控，对于神经元的范畴来讲，我们应该首先对处理组的目标细胞进行了10×Genomics scRNA-seq。首先，确定了与处理组密切相关的新聚类簇。然后，结合表面标志物分析新聚类簇。此外，如果我们还想加深文章的层次，还可以重建了与神经元类型相关的基因调控网络。最后，再检测了功能基因的表达变化，揭示了相关的分子是一个新的潜在的治疗靶点。这样一篇高分的文章就出现了~
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参考文献
[1] D.T. Paik, S. Cho, L. Tian, H.Y. Chang, J.C. Wu, Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine, Nat Rev Cardiol, 17 (2020) 457-473.
[2] L. Wang, P. Yu, B. Zhou, J. Song, Z. Li, M. Zhang, G. Guo, Y. Wang, X. Chen, L. Han, S. Hu, Single-cell reconstruction of the adult human heart during heart failure and recovery reveals the cellular landscape underlying cardiac function, Nat Cell Biol, 22 (2020) 108-119.
[3] D. He, D. Wang, P. Lu, N. Yang, Z. Xue, X. Zhu, P. Zhang, G. Fan, Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneous tumor and immune cell populations in early-stage lung adenocarcinomas harboring EGFR mutations, Oncogene, 40 (2021) 355-368.
[4] L.L. Petrilli, F. Spada, A. Palma, A. Reggio, M. Rosina, C. Gargioli, L. Castagnoli, C. Fuoco, G. Cesareni, High-Dimensional Single-Cell Quantitative Profiling of Skeletal Muscle Cell Population Dynamics during Regeneration, Cells, 9 (2020).
[5] K. Wang, S. Wang, Y. Chen, D. Wu, X. Hu, Y. Lu, L. Wang, L. Bao, C. Li, X. Zhang, Single-cell transcriptomic analysis of somatosensory neurons uncovers temporal development of neuropathic pain, Cell Res, 31 (2021) 904-918.
