今天要给大家介绍一篇2021年7月份发表自Frontiers in Cell and Developmental Biology (IF: 6.684)，该文章通过对预后相关基因、驱动基因、信号通路和免疫活性的多组学分析揭示了乳腺癌的亚型特异性分子特征。

Uncovering the Subtype-Specific Molecular Characteristics of Breast Cancer by Multiomics Analysis of Prognosis-Associated Genes, Driver Genes, Signaling Pathways, and Immune Activity

文章背景

乳腺癌是一种异质性疾病。2000年，Perou首先报道了基于分子特征的乳腺癌分类，即管腔亚型（lumA和lumB）、basal-like亚型、HER2过表达亚型和正常乳腺样亚型。每个亚型都有独特的分子特征、预后、临床行为和治疗反应。例如lumA和lumB亚型患者的预后相对较好，主要治疗方法为手术、化疗和内分泌治疗。basal-like亚型患者5年生存率低，缺乏有效的治疗方法。HER2亚型患者通常接受靶向药物或放化疗，直到肿瘤缩小到特定大小范围后，才能进行手术切除。

目前，众多关于乳腺癌的研究都集中在肿瘤的发生、发展、治疗和改善预后方面。越来越多的研究表明，传统的癌症免疫组织化学分类在理解乳腺癌异质性方面存在一些局限性。通过不同分子水平的计算生物学方法，可以开发更准确、更有帮助的乳腺癌亚型预测模型，弥补免疫组化分型的不足。此外，通过更深入的乳腺癌研究机制，可以揭示有效的治疗方案。然而，不同的分子亚型对治疗和预后的影响不同，其机制尚不清楚。

文章结果

乳腺癌中分子亚型特异性RNA的鉴定

为了探索乳腺癌分子亚型之间的差异，作者首先使用PAM50方法来预测来自TCGA的1,217个乳腺癌样本的分子亚型。预测结果显示，每个乳腺癌亚型的样本数为lumA：362，lumB：282，HER2：155，basal-like：233，正常：185（图1A）。然后作者计算了每个亚型中特异性表达的RNA的数量（图1B）。比较了每个亚型中mRNA、lncRNA和miRNA的差异表达水平（图1C、D）。生成了Kaplan-Meier生存曲线来探索亚型特异性RNA和OS之间的潜在联系。在这些RNA中，共有25个RNA的预后有意义（图2，p<0.05）。这些基因被认为是潜在的乳腺癌亚型相关的预后基因。

图1：不同亚型特异性RNA的表达

图2：乳腺癌不同亚型特异性RNA表达与生存率的相关性

乳腺癌不同亚型中的基因突变

作者分析了每个亚型的突变，包括基因突变和CNV。这些突变根据不同类别进行分类，其中错义突变占最大部分（图3A）。lumA亚型的错义突变最多，lumB亚型的错义突变最少（分别为16,967和13,364个突变）。五个亚型的CNV分析显示，在basal-like和lumB亚型中检测到最高水平的扩增和缺失突变（图3B）。五种亚型的比较显示，它们的C>T颠换增加（图3C）。HER2亚型的C>G颠换明显高于其他亚型。basal-like亚型比其他亚型具有更多的T>C颠换。作者进一步对亚型特异性基因进行了突变分析，其中每个亚型的mRNA表达显着不同。结果表明，这些基因的突变与其RNA表达水平相关（图3D、E）。

图3：不同乳腺癌亚型的DNA突变分析

乳腺癌不同亚型中驱动基因的鉴定

为了进一步了解不同乳腺癌亚型的分子特征，作者使用DriverDBv3在线数据库预测TCGA数据库中乳腺癌样本的驱动基因。为了提高结果的准确性，作者使用了超过7种算法来同时预测驱动基因，并获得了11个驱动基因，即ERBB2、AKT1、PIK3CA、PIK3R1、PTEN、TP53、CDH1、GATA3、MAP2K4、CTCF和FOXA1。然后分析了不同亚型中驱动基因的表达，发现肿瘤样本中PIK3CA、PIK3R1和PTEN的表达显着低于正常样本（图4A））。ERBB2、GATA3、PIK3CA、MAP2K4等驱动基因在特定亚型中要么显着过表达要么低表达，表明这些基因在不同亚型中对肿瘤的形成和进展具有重要意义，或许可能作为亚型鉴定的标志物和乳腺癌治疗的靶点。

其他研究也表明，乳腺癌细胞往往存在许多驱动基因突变。为了更直观地展示驱动基因对乳腺癌患者预后的影响，作者分析了各亚型的驱动基因突变，以及不同信号通路中频繁改变的基因和重要癌基因的异常变化。来自不同亚型乳腺癌患者的大部分样本在MAP2K4、TP53和PIK3CA基因中存在异常突变（图4B））。basal-like亚型中TP53的变化频率比其他亚型更显着，而PIK3CA的错义突变在lumA亚型中更广泛。此外，许多HER2亚型患者存在ERBB2基因改变，而lumB亚型患者存在MAP2K4缺失。我们发现MDM4、MTOR、MYC、CCND1和RB1等10条经典信号通路中的一些关键癌基因和抑癌基因突变比例较高。

接下来，作者评估了驱动基因突变对乳腺癌患者预后的影响。根据驱动基因是否有突变、CNV或基因融合的变化将每个亚型的样本分为改变组和非改变组。本次分析发现，异常突变的ERBB2和FOXA1组在lumB亚型组的预后显着低于未改变组，而异常突变的AKT1和GATA3组在HER2亚型组的预后显著低于未改变组。lumA亚型组中异常突变的CDH1组的预后显着高于未改变组。（图4C）

图4：不同乳腺癌亚型中的驱动基因分析

不同乳腺癌亚型中免疫细胞浸润的差异

乳腺癌样本中的大量突变表明基因组稳定性较差，肿瘤组织中的许多突变可以诱导新抗原的产生。同时，具有特定基因突变的患者是免疫治疗的合适人选，例如具有BRCA1/2基因突变的患者。因此，需要研究乳腺癌不同亚型之间免疫细胞浸润的差异从而确定患者的个性化免疫治疗。在这里，作者使用CIBERSORT分析了每个亚型肿瘤组织中22种免疫细胞类型的浸润差异。在恶性程度较高的basal-like和HER2亚型的肿瘤组织中，M1巨噬细胞、活化记忆CD4 T细胞和CD8 T细胞的浸润水平显着升高。相比之下，M2 巨噬细胞、naïve B细胞和静息记忆 CD4 T细胞的浸润水平显着降低（图5A）。然后，作者使用MCP counter来分析每个亚型的成纤维细胞浸润水平（图5B)，其中lumB和basal-like亚型中成纤维细胞的浸润水平较低。

此外，作者分析了各亚型中TMB与免疫细胞浸润的相关性，发现HER2突变与NK细胞浸润显着相关，其他亚型与T细胞浸润显着相关（图5C、D）。basal-like亚型与CD4 T细胞浸润显着相关，lumB 亚型与CD4和CD8浸润显着相关。这表明具有较高TMB的basal-like亚型和lumB亚型肿瘤具有更多的T细胞浸润和较低的成纤维细胞浸润。

然后，作者评估了不同亚型之间免疫细胞浸润与预后之间的相关性（图6A）。结果表明，低程度的记忆B细胞浸润在lumA和lumB亚型组的预后较好，而低水平naive B细胞浸润在lumA亚型组的预后较差。HER2亚型组中Treg细胞浸润高的病例生存期更长；basal-like亚型组中高M2巨噬细胞浸润的预后较差。以上结果提示不同亚型中的免疫细胞浸润与患者预后有关。

图5：不同乳腺癌亚型中的免疫细胞浸润水平分析

图6：不同乳腺癌亚型中免疫细胞和TMB的Kaplan Meier生存曲线

不同乳腺癌亚型对免疫疗法的不同反应

为了评估不同亚型对免疫治疗的不同反应，作者分析了乳腺癌免疫检查点基因的mRNA表达，即PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、VTCN1、IDO1和TIM3（图7A）。PD-L1和PD-L2在basal-like亚型中的表达明显高于其他亚型（图7B）。其他免疫检查点基因（CD40、CD80、CD86、IDO1和LAG3）的表达在basal-like亚型中也显着升高（图7A）。然后，作者使用免疫表型分析来预测不同亚型之间对anti-PD-1/PD-L1治疗的反应。作者发现在CTLA4_negative+PD-1_negative亚型中，lumB和HER2亚型表现出比其他亚型更低的IPS（图7C）。在CTLA4_negative+PD-1_positive和CTLA4_positive+PD-1_positive亚型中，basal-like亚型的IPS显着更高（图7C）。作者评估了不同亚型之间免疫检查点基因表达与预后之间的相关性。结果显示，PD-L2表达水平较高的basal-like亚型患者的预后生存较好（图7D））。这些结果表明，basal-like亚型的患者可能对anti-PD-1/PD-L1治疗或anti-PD-1/PD-L1和anti-CTLA4治疗的组合有更高的阳性反应。

图7：不同亚型乳腺癌患者中PD-L1表达水平和IPS的相关性

文章小结

作者使用了PAM50亚型预测算法对TCGA公共数据库中的乳腺癌样本进行分类，并在DNA和RNA水平上分析了亚型之间的差异。分析了不同亚型中驱动基因突变、拷贝数变异(CNV)和基因融合的差异，并评估了它们的预后影响。为了评估亚型之间免疫细胞水平的差异，作者分析了免疫细胞和癌症相关成纤维细胞(CAF)的浸润水平。作者旨在通过生物信息学方法确定不同亚型之间的潜在差异，为临床攻克不同亚型乳腺癌寻找合适的治疗靶点。

该文章所用的方法简单，且分析思路清晰，灵活使用数据库，对于想要研究肿瘤相关亚型的生物信息学的人，你还不行动起来嘛！