今天要给大家介绍一篇2021年8月份发表自Frontiers in Oncology(IF: 6.244)文章，在该研究中，作者确定了CLM潜在生物标志物，它们将为早期诊断和预后提供潜在价值，并促进CRC和CLM的分子靶向治疗。

Identification of Candidate Biomarkers and Prognostic Analysis

in Colorectal Cancer Liver Metastases

文章背景

结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。据全球癌症统计，2020年报告的新发CRC病例超过190万例，死亡93.5万人，约占癌症病例和死亡人数的十分之一。总体而言，CRC的发病率在全球排名第三，死亡率排名第二。结直肠癌肝转移(CLM)是造成这种高死亡率的主要原因之一，发生在30%的CRC患者中，占相关死亡人数的三分之二。此外，超过50%CLM患者在切除术后2年内复发。

大量临床数据表明，肝脏是结直肠癌转移最常见的靶器官。迄今为止，该病进展过程中肝转移形成和进展的相关机制已被广泛研究，但其发病机制尚未完全阐明。事实上，CLM的发生和发展涉及多种功能信号通路中的无数表观遗传和遗传变化。这些不同的网络容易受到遗传和表观遗传事件的调控，导致基因表达的多样性。因此，需要利用生物信息学方法，从而筛选出合适的生物标志物并指导临床全身预防、诊断和治疗方案的选择。

文章结果

差异基因的筛选和鉴定

作者从GEO数据库（GSE6988、GSE14297和GSE81558数据集）中筛选了来自CRC和CLM组织样本的微阵列数据集。其中，GSE6988基于GPL4811平台，于2008年2月1日发表。来自这个人类CLM标记的全基因组数据集，包括123个样本，其中包含25个正常结直肠粘膜、27个原发性CRC、13个正常肝组织和27个肝转移，以及20个没有肝转移的原发性CRC组织，作者从26对有转移性肝组织的原发性CRC中选择了样本数据。GSE14297基于GPL6370平台，于2009年1月13日发表。来自这个原发性CRC和相关肝转移表达谱数据集，共包含48个样本，包括18个初级CRC，18个肝转移、7个正常结直肠粘膜组织和5个正常肝组织，作者从18对CRC和肝转移组织中选择数据。GSE81558基于GPL15207平台，于2017年6月12日发布。该CRC患者肝转移数据集共51个样本，包括23个原发性CRC，19个肝转移和九个正常结肠黏膜组织，作者选择了19对CRC原发癌和肝转移组织样本数据。然后，作者使用GEO2R对原始数据进行预处理和过滤，以p<0.05和[log FC]>1作为筛选标准，最终分别从这三个表达谱数据集中提取了315、233和117个差异（图 1A-C）。使用FUNRICH软件，作者从这三个基因组数据集中鉴定了35个一致的DEG（图2A），包括4个下调和31个上调的基因（图2B、C）。此外，R软件（版本3.6.3）用于执行聚类分析并绘制热图以显示来自三个数据集的35 DEG的表达（图1D-F）。

为了确认从GEO数据集中识别的DEG的可靠性，作者还分析了来自GEO数据库的GSE49355数据集以进行验证（图2D、E）。根据使用FUNRICH软件的VENN图结果，在本研究中鉴定的35个DEG中有30个在GSE49355数据集中显著过表达。此外，GSE49355数据集中的四个基因也显著下调，只有1个上调基因不存在于基因列表中（图2F）。上调和下调基因的表达模式相似度为97.14%，表明本研究鉴定的候选基因是可靠的。

图1

图2

GO富集分析和信号通路富集分析

GO 富集分析

来自注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)的GO分析表明，在生物过程中（图3A），DEGs在许多过程中富集，例如急性炎症、翻译后蛋白质修饰、血小板脱粒、调节凝血和纤溶系统以及调节蛋白质激活级联反应。对于分子功能（图3B)，DEGs主要富集在调节丝氨酸内肽酶抑制剂和水解酶活性、肽酶调节剂活性、糖胺聚糖结合、肝素和胶原结合等过程中。在细胞成分（图3C）中，DEGs主要富集在介导细胞外空间、细胞外区域、内质网、内膜系统、血小板α-颗粒和细胞质囊泡的过程中。

这些结果表明，DEGs主要富集在细胞外区、内质网和血小板α颗粒中，主要参与炎症、血小板脱颗粒、肽酶调节、蛋白质代谢以及凝血和纤溶系统的调节。

信号通路富集分析

分析结果表明，候选DEG具有共同的信号转导途径和反应过程（图3D），主要富集在补体凝血级联、药物代谢（即代谢酶，如细胞色素P450）和类固醇激素合成中的那些。作者还发现这些DEG在以下途径中发挥作用：化学致癌作用、异生素代谢通过细胞色素P450、亚油酸代谢、调节胰岛素样生长因子(IGF)转运和摄取的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、翻译后蛋白磷酸化、血小板脱颗粒、激活、聚集和其他信号通路.其中，补体凝血级联、血小板活化、脱颗粒和聚集、IGFBP-IGF信号和药物代谢是关键的信号转导途径。

图3

PPI 网络筛选和富集分析

关键基因的筛选与模块化分析

作者使用STRING数据库将35个DEG过滤成包含35个节点和189条边的PPI网络（图4A），平均节点度为10.8，平均局部聚类系数为0.66，PPI浓度p值小于1e-16。其中，35个DEG中有4个（AADAC、FOXF1、CTSK和VNN1）不属于PPI网络；因此，作者最终筛选了31个DEG为关键基因的。同时，利用k-means聚类分析，将35个DEGs分为三类，选出26个关键基因。然后，作者使用CYTOSCAPE去除无节点基因，并根据节点之间的交互和表达制作PPI网络图（图4B、C）。在CYTOSCAPE中使用MCODE模块分析，筛选出18个候选基因（图4D-H）。

基于使用STRING数据库的PPI网络分析，作者将26个关键DEG分为两个模块。模块1主要调节IGFBP-IGF信号通路，而模块2包括属于补体凝血级联。具体而言，模块1包括基因IGFBP1、SPARCL1、CDH2、ITIH2、F5、APOA2、TF、CP、FGA、SERPINC1、F2和PLG。模块2包括基因C4BPA、F5、FGA、SERPINC1、F2、PLG、SERPINA5和VTN。F5、FGA、SERPINC1、F2和PLG同时参与这两种途径。此外，FMO3、CYP2E1、CYP3A4和UGT2B4在药物代谢-细胞色素P450信号通路中富集。根据三个功能团的分析，26个DEG在细胞外区富集，7个DEG在血小板α颗粒中富集，18个DEG在内质网富集。

图4

基因集富集分析(GSEA)

作者使用GSE6988基因集进行富集分析。从GSE6988数据集中共筛选出9587个有效基因，基因组大小过滤标准设置为“最小等于15，最大等于500”。总共去除了8722个基因集，剩余的17002个基因集用于富集分析。根据分析结果，在CLM表型中，有6014个基因集上调；FDR<25%条件下，970个基因集显著富集；在p<0.01条件下，440个基因集显著富集；在p<0.05的条件下，945个基因集显著富集。在CRC表型中，10988个基因组被上调；17个基因在FDR<25%条件下富集；在p<0.01条件下，219个基因集显著富集；在p<0.05条件下，898个基因集显著富集。本研究以“|NES|>1, NOM p-val<0.05, and FDR q-val<0.25”作为显著通路富集的标准，并且从CLM组和CRC组中选择了富集评分最高的20个基因集（图 5）。结果表明，以血小板为中心的血细胞和内皮细胞的活化（导致细胞运动、分泌、酶产生的改变）、Ca2+代谢和内吞作用（图5D）、炎症和血管通透性破坏在CLM组中富集。此外，GSEA基因序列中前100个基因中有14个属于先前筛选的18个DEG。

图5

表达分析

作者使用ONCOMINE（图6）、GEPIA2和UALCAN数据库分析了18个候选基因在癌组织和邻近正常组织中的表达情况。结果显示SPARCL1、CDH2、CP、HP、TF和SERPINA5在癌组织中均显著下调（p<0.05；图7A-F）。此外，CDH2、SPARCL1和TF在CRC的病理阶段显著差异表达（p<0.05；图7G-L）。此外，SPARCL1、CP和TF的表达式IV期结肠癌和正常之间存在显著差异（p<0.05；图8A-F），而SPARCL1、CDH2、CP和SERPINA5在直肠腺癌和正常组织之间存在显著差异（图8G-L）。

图6

图7

图8

预后分析和相关分析

最后总共有六个基因被鉴定为候选生物标志物。生存曲线分析结果表明，有两个DEGs（CDH2和SPARCL1）被认为是预后因素（p<0.05）。此外，发现CDH2和SPARCL1表达水平与预后显著相关。同时，基于结合对数秩p检验的Kaplan-Meier曲线，CDH2与CRC的总生存期（OS；p<0.01）和无病生存期（DFS；p<0.01）明显相关（图9，图10A-D）。此外，观察到CDH2和SPARCL1的表达之间有很强的相关性（图10E-H）。

图9

图10

为了揭示使用TCGA数据库识别的关键基因是否在其他CRC病例中表现出相同的预后价值，作者使用GSE17538数据集和GSE50760作为验证集。HPX、CDH2、VTN、IGFBP1、CP、HP、ORM2、APOA2、TF、HRG、PLG、SERPINA5、ITIH2、SERPINC1、FGA、F2和GC在CLM样品中上调。同时，SPARCL1、ORM2、IGFBP1、FGA、APOA2和VTN显著差异表达（校正p值<0.01）。此外，CDH2和SPARCL1与CRC的不良预后相关，表明两者都可能代表CRC不良预后的潜在遗传生物标志物，并可能为未来的CRC治疗提供潜在价值。（图11）。

作者还观察到CDH2、CP、HP、TF和SERPINA5在肝转移癌组织中上调，在原发癌组织中下调；而SPARCL1表现出相反的表达模式。此外，与CRC组织相比，SPARCL1、CDH2、CP、HP、TF和SERPINA5在正常结直肠组织中的表达相对较高。此外，与肝转移癌组织相比，CP、HP、TF和SERPINA5在正常肝组织中表达上调，而CDH2和SPARCL1的表达在两种组织间无显著差异。因此，在观察到的组织中，SPARCL1在正常结直肠组织中表达最高，CDH2在正常肝组织和肝转移癌组织中表达最高，而CP、HP、TF和SERPINA5在正常肝中表达最高。

图11

遗传改变和共表达分析

作者使用TCGA的Pan Cancer Atlas对六个关键基因（CDH2、SPARCL1、CP、HP、TF和SERPINA5）的分子特征进行了综合分析。结果表明，CDH2、SPARCL1、CP、HP、TF和SERPINA5分别在16%、7%、10%、6%、8%、8%的CRC样本中发生了突变。此外，6个关键基因在213个（36%）样本中发生了改变。mRNA表达增强是这些样品中最常见的变化。作者接下来探索了这些枢纽基因的潜在共表达，发现CDH2、SPARCL1、CP、HP、TF和SERPINA5的表达表现出显著的相关性，在CDH2和SPARCL1之间观察到的关联最强（图12）。

图12

使用临床组织样本进行预后基因验证

为了进一步证实具有预后价值的hub基因的预后价值，作者使用免疫组织化学（IHC）染色检测正常组织和肿瘤组织中CDH2和SPARCL1的蛋白表达。结果表明，与正常组织相比，CDH2和SPARCL1在原发性结直肠癌组织中显著低表达。同时，SPARCL1在正常结直肠组织中相对高表达，CDH2在正常肝组织中高表达（图13），与作者的研究结论一致。

图13

文章小结

总之，补体凝血级联和IGFBP-IGF通路可能是CLM的关键信号通路。作者发现HPX、SPARCL1、CDH2、VTN、IGFBP1、CP、HP、ORM2、APOA2、TF、HRG、PLG、SERPINA5、ITIH2、SERPINC1、FGA、F2和GC是关键基因，SPARCL1、CDH2、CP、 HP、TF和SERPINA5发挥着核心作用。 此外，CDH2和SPARCL1与CRC的预后显著相关。识别这些候选基因并针对这些特定途径可能更准确地诊断、预防和治疗CRC和CLM。

该文章所用的方法简单，利用数据库分析，全程无代码且分析思路清晰，看了这篇文，对于想要研究肿瘤相关的生物信息学的人，你还不行动起来嘛！