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小编总结：
单细胞分析是最近的研究热点，其基础分析的思路要经历以下几步：
1.细胞鉴定（在这里我把质控省去了，因为文献一般会把这步放入补充材料中），单细胞数据分析的第一步是分亚群，亚群分好之后最重要的一步（也是最难的一步）就是对亚群进行细胞类型注释。一般结合细胞类型Marker基因、细胞类型注释软件和文献数据做比对的方法综合进行注释，从而获取样本中真正的细胞类型组成。
2.对于单细胞多样本差异分析。主要分为两大类：差异表达和差异丰度，前者检测相同类型细胞在不同条件下表达的变化，后者检测不同条件下细胞类型组成的变化。通过样本间比较发现新的细胞亚群或比例差异显著的亚群。
3.发育分化等多时间点的设计可以获取随着时间和分化进程细胞类型或基因的动态变化。通过多样本差异比较可以帮助挖掘与疾病、发育相关的关键细胞亚群或基因，筛选疾病标志物，是单细胞数据分析必做的一步。
4.上下游富集分析。GSEA富集分析可以预测不同细胞类型预先定义的基因集的基因分布趋势，从而判断其对表型的影响。GSVA富集分析主要评估不同的代谢通路在不同细胞类型或样品间是否富集。Pathway分析：基于分子研究上下游通路关系。
文章简介：
这篇文章1发表在Nature Communications杂志上，在最近一年的影响因子: 14.919比上一年增加2.798。这篇文章无论是思路还是作图都非常全面解读单细胞类文章的基础思路。
背景知识：
鼻咽癌(NPC)的肿瘤微环境(TME)是一个异质的、动态的间质群体。全面了解这一肿瘤特异性生态系统对于提高癌症诊断、治疗和预后是必要的。作者报告了TME中具有高度代表性的特征，包括表型丰度、遗传变化、免疫动力学、克隆扩张、发育轨迹和分子相互作用，这些特征深刻地影响着患者的预后和治疗结果。
结果解读：
本研究共入选14例患者，其中11例被诊断为鼻咽癌，另外的被诊断为鼻咽淋巴增生(NLH)。通过使用唯一分子识别符(UMI)对每个单个细胞进行编码，然后进行计数分析(Fig.1a)。作者获得了66,627个细胞，其中50,169个细胞(75%)来自NPC微环境，16,458个细胞(25%)来自非恶性微环境，平均每个细胞检测到1215个中位基因和99739个中位读数(Fig.1b)。然后作者使用UMAP方法进行降维处理，实现了细胞分布的可视化。在此基础上，作者通过公认的标记基因将这些簇划分为六个主要的细胞谱系(Fig.1b, c)。尽管髓系细胞和成纤维细胞在TME中表现出强烈的偏好，但大多数簇既不是肿瘤特异性的，也不是患者特异性的，这表明主要基质谱系的组成没有广泛的差异(Fig.1b, e)。再用免疫组织化学组化鉴定患者的间质浸润程度(Fig.1f)。鼻咽癌微环境中T细胞和B细胞是最主要的细胞类型(Fig.1d)。
从32,656个T细胞中产生了14个亚群，代表了鼻咽癌微环境中最普遍和最多样化的细胞类型(Fig.2a)。用标记基因来鉴定和表征肿瘤浸润性T细胞亚群(Fig.2d)。例如，用LAG3、HAVCR2和TOX鉴定和表征了三个不同的耗竭T细胞亚群，这三个亚群以前在T细胞功能障碍中被报道过。虽然大多数T细胞亚群在患者间表现出轻微的异质性，但相对丰度和激活/抑制特征有很大不同(Fig.2c, d)。在鼻咽癌微环境中观察到两个耗竭T细胞亚群，其特征是高表达免疫检查点分子HAVCR2和耗竭相关转录因子TOX (Fig.2c)。其他T细胞亚型，包括调节性T细胞和活化T细胞，也优先在TME中浸润，而幼稚T细胞和中央记忆性T细胞更可能存在于非恶性微环境中。通过Deconvolution分析，证实了作者的发现。鼻咽癌患者的效应T细胞亚型、耗竭T细胞亚型和抑制性T细胞亚型高度富集(Fig.2c)。作者通过CD3、CD8、FOXP3和PD-1的多色免疫荧光进一步验证了耗竭T细胞亚型和Treg细胞的富集，显示出与作者的单细胞数据一致的结果(Fig.2e)。这提示T细胞功能紊乱和免疫抑制在很大程度上影响了T细胞对鼻咽癌的免疫功能。因此，作者后来比较了鼻咽癌和非恶性微环境来源的T细胞的标志性通路。通路分析显示，鼻咽癌来源的T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)和干扰素-α(IFN-α)反应途径上调，提示慢性激活导致的1型和2型干扰素(IFN)的过表达可能显著影响浸润的T细胞的组成和功能状态(Fig.2f)。来自非恶性微环境的T细胞主要受NF-κB途径的影响(Fig.2f)。总体而言，鼻咽癌来源的T细胞与NLH(鼻咽淋巴增生)来源的T细胞相比，表现出明显的功能差异。进一步证实鼻咽癌组织中T细胞浸润与非恶性微环境之间的存在分子差异。
作者进行了MAST分析以确定T细胞中的差异表达基因(Deg)(Fig.3a)。其中，作者通过RegNetwork预测了前30个上调基因的上游转录因子，并通过Cytoscape构建了基因调控网络(Fig.3b)。作者发现CXCL13和LGALS1在鼻咽癌来源的T细胞中显著上调的。CXCL13是滤泡辅助性T细胞的基因标志之一。但在耗竭T细胞中，特别是PD-1+T细胞上也有高表达(Fig.3c)。因此，作者根据CXCL13基因表达的中位数将鼻咽癌患者分为CXCL13高表达组和CXCL13低表达组。在CXCL13高表达组，作者观察到CXCR5+B细胞比例显著高于CXCL13低表达组(Fig.3e)。此外，CXCL13的高表达与鼻咽癌患者更好的生存相关，这表明CXCL13高表达的耗竭T细胞可能仍然有利于免疫调节(Fig.3f)。据报道，LGALS1在多种免疫细胞中具有免疫调节功能，本研究发现LGALS1在鼻咽癌相关Tregs中高表达(Fig.3d)。作者还发现，在LGALS1高的患者中，免疫抑制Tregs的比例明显高于静息Tregs，这表明LGALS1可能在Treg激活中起重要作用(Fig.3e)。尽管LGALS1可能成为恢复Treg免疫抑制功能的一个有前途的治疗靶点，但LGALS1缺陷如何影响Treg活性的分子机制仍很不清楚。基于基因调控网络，发现S100A11和S100A4在LGALS1+Treg中上调，作者预测与LGALS1相互作用的可能通路，发现其调控作用可能是通过钙通道依赖的过程来实现的(Fig.3b)。
下游分析揭示了一组丰富的功能模块，这些模块与T细胞亚群中的幼稚、细胞毒性、耗竭和免疫调节类有关。因此，作者确定这些T细胞亚群中最具代表性的基因，包括CCR7(幼稚)、NKG7(细胞毒性)、LAG3(耗竭)和FOXP3(Treg)。作者后来构建了包含与代表性基因最相关的前十个基因的基因图谱(Fig.3g–j)。作者首先对CD8+T细胞簇内的细胞毒活性方案进行了定量比较。结果表明，耗竭T细胞群(C5、C6和C7)保持了中到高的细胞毒活性，这提示在TME中可能存在一个过渡过程，由于慢性激活和肿瘤依赖机制，效应性T细胞逐渐失去细胞毒性(Fig.3g)。此外，对耗竭程序的分析表明，耗竭状态不仅在耗竭T细胞中产生，而且在效应T细胞中也可以被诱导，但程度较低，说明激活-耗竭的转变确实是一个动态过程(Fig.3h)。对所有T细胞进行的幼稚程序的定量分析表明，CD4+和CD8+幼稚T细胞具有较高的幼稚分数(Fig.3i)。对Treg程序的分析表明，抑制性Treg比静息Treg具有更强的免疫调节能力(Fig.3j)。这可能是抑制性Tregs中分子编码基因的高表达导致的，其中包括CD27、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF18和ICOS。为了验证线性模型的可靠性，作者进行了功能评分并进行T细胞亚群之间丰度的相关性分析。结果表明，功能评分与T细胞丰度高度相关，提示线性模型可以全面、准确地估计鼻咽癌微环境中T细胞动态功能状态(Fig.4a)。此外，作者分析了Chen等人研究的一个独立的单细胞队列中的T细胞亚群。结果表明作者的模型在Chen的数据中计算的功能分数与T细胞亚群的丰度高度相关，这进一步证明了作者线性模型的可靠性(Fig.4b)。功能评分与相应基因显著相关，表明与基于签名的表征方法相比，线性模型能够更全面、更准确地从批量RNA测序数据中量化真实的动态T细胞功能状态(Fig.4c)。
为了研究浸润的T细胞在鼻咽癌和非恶性微环境中的克隆性多样性，作者系统地分析了单个T细胞上TCR。总体而言，每个患者检测到2071个独特的克隆类型。克隆类型在所有患者中是高度不同的，但在NPC和NLH患者中克隆大小的组成相对保持一致。因此，作者根据分配给每个克隆的细胞数量将克隆类型分为三类(Fig.5a)(克隆大小≥3,=2和=1)。根据克隆细胞数量，表明T细胞在颞下颌关节周围有很强的克隆性增殖(Fig.5b)。相比之下，T细胞在非恶性微环境中的扩张相对静止，因为它主要由具有小克隆的T细胞主导(Fig.5b)。作者后来计算了4-13名患者的耗竭和Treg评分，发现这两个评分都与较大(克隆大小≥为3和=2)克隆性呈正相关。这一结果表明，鼻咽癌患者TME中耗竭T细胞和Tregs经历了快速的克隆性增殖，并最终导致了这些T细胞亚型的高丰度(Fig.5c)。
为了进一步了解克隆扩增及其对T细胞动力学的影响，每个患者中最大的三个克隆及其相应的克隆类型用UMAP进行可视化(Fig.5d)。如图所示，不同转录状态的C5-LAG3、C6-HAVCR2和C7-TOX耗竭T细胞表现出不同的细胞毒性和耗竭活性。发育轨迹提供了一种独特的可视化方法，可以推断鼻咽癌和非恶性微环境中T细胞的谱系结构。CD8+T细胞的运动轨迹显示，HAVCR2耗竭、TOX耗竭、LAG3耗竭和TRM分别位于不同分支的末端，表明了它们不同的发育过程(Fig.5e)。轨道上的CD4+T细胞也表现出从幼稚T细胞向Tregs、中央记忆T细胞和T滤泡辅助细胞的过渡过程(Fig.5f)。假时间估计表明静息Tregs是一个发育较早的亚型，这进一步支持了作者先前的发现，即抑制性Tregs作为一种更成熟的形式，具有更强的免疫调节能力，并经历了更强劲的克隆扩张。
B细胞以前被认为是TME中相对均一的种群。作者在11个不同的亚型中检测到27,506个B细胞(Fig.6a, b)。在患者2、6和7中，血浆B细胞被特异性地富集，这导致了在患者间鼻咽癌微环境中的B细胞出现了异质性 (Fig.6c)。虽然血浆B细胞和记忆B细胞的数量在TME中显著增加，但由于患者间存在较大差异，这一数字并未达到统计学意义(Fig.6c)。在非恶性微环境中发现总幼稚B细胞和ILB细胞富集，而NPC中尤其富含IFN诱导的B细胞(包括幼稚B细胞)和双阴性B细胞(Fig.6d)。Deconvolution分析证实血浆B细胞和双阴性B细胞更有可能渗透到鼻咽癌微环境中。而PAN B细胞，包括幼稚B细胞、未活化B细胞和先天B细胞，在非恶性微环境中优先富集(Fig.6e)。与T细胞亚群的结果一致，B细胞的通路分析表明，鼻咽癌来源的B细胞也受到干扰素-γ和干扰素-α释放的影响，而NLH来源的B细胞则因炎症紊乱而改变(Fig.6f)。为了进一步了解B细胞浸润的功能，作者进行了克隆分析，以量化每个患者中克隆类型的分布和多样性(Fig.6g)。总体而言。与T细胞结果相似，鼻咽癌患者中较大的B细胞克隆显著丰富，而NLH患者中较小的克隆更为丰富(Fig.6h)。
将3671个髓样细胞分成11个亚群，作者发现95%的髓样细胞来源于鼻咽癌患者，表明髓样细胞的聚集是一个NPC依赖的过程(Fig.7a, b)。作者的单细胞数据显示存在三个主要的髓系成分，包括髓系抑制细胞(MDSCs)、巨噬细胞和树突状细胞(DCs) (Fig.7c)。并将这些细胞进行更细致的分类 (Fig.7a, d)。与T细胞和B细胞亚群相比，髓系细胞，特别是TAMs，由于患者间的差异和组织特异性，表现出广泛的异质性(Fig.7e)。例如，来自患者6(C1、C2和C3)和患者8(C4)的TAMs表现出高度不同的遗传特征(Fig.7c)。此外，Deconvolution分析显示，鼻咽癌患者的MDSC高度富集(Fig.6f)。NPC来源的和NLH来源的髓样细胞的通路富集证实，IFNs的也参与塑造了NPC患者的髓样结构(Fig.7g)。
成纤维细胞和NK细胞所表示两种次要亚群在NPC微环境。NPC患者中的成纤维细胞大量富集（图1d,e）。MAST分析揭示了在成纤维细胞和NK细胞中不同的基因表达谱。编码细胞外基质（ECM）成分（例如COL1A1，COL1A2，LUM和FN1）的基因特异性表达是由成纤维细胞表达的，这表明，鼻咽癌微环境中的ECM非常复杂，可能通过整合素信号与周围的肿瘤和基质细胞相互作用。抑制肿瘤和免疫细胞上的特定整合素受体可能作为一个潜在的治疗靶标。类似于效应T细胞，NK细胞通常表达高水平的细胞毒性基因，包括NKG7，GZMA，GZMB和GZMH。NK细胞在慢性激活后KIR、NKG2A、LAG3和HAVCR2的上调，但作者没有观察到NK细胞中这些衰竭标志物的上调情况。
基于作者的单细胞测序数据，作者利用标注签名矩阵对88例鼻咽癌患者的RNA测序数据进行Deconvolution，通过CIBERSORTx估计免疫丰度(Fig.8a)。每个患者的功能评分也被计算并归一化，随后被用来表征T细胞的动态状态(Fig.8b)。随后，作者评估了每个免疫亚型和患者群的风险比。结果表明，耗竭T细胞表现出较好的无进展存活率，而其他T细胞亚型与存活率没有明显的相关性(Fig.8c)。
为了描述来自NPC微环境和NLH微环境的细胞间的分子相互作用异，作者应用CellPhoneDB在38个已鉴定的亚群中构建了一个细胞-细胞通讯网络。由于T细胞和B细胞在微环境中高度浸润，作者主要观察了T和B亚群内的细胞通讯(Fig.9a)。作者发现，与抑制性Tregs相比，静息Tregs与耗竭 T细胞的相互作用恨少，这表明它们是一种动力较弱、免疫抑制程度较低的亚型(Fig.9b)。与上述发现一致的是，TME中的HAVCR2和TOX耗竭T细胞主要通过CXCL13-CXCR5轴与不同的B细胞亚群表现出很强的相互作用(Fig.9c)。值得注意的是，与非恶性T细胞相比，NPC来源的耗竭T细胞和抑制性Tregs拥有更多的配体-受体对，而静息Tregs、双阴性B细胞和组织驻留的T细胞拥有更少的配体-受体对(Fig.9d)。
参考文献
1. Gong L, Kwong DL, Dai W, et al. Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun 2021; 12(1): 1540.
