新冠病毒的研究中多是通过体内、体外实验及组学分析，寻找有效的治疗手段，但今天和大家分享发表在Journal of Biomolecular Structure and Dynamics上的一篇利用计算模拟筛选出抗COVID-19的小分子候选药物：Stilbene-based natural compounds as promising drug candidates against COVID-19。

一.  研究背景

二苯乙烯类是一种天然的多酚类化合物，因其在人体中不同的生理作用而被广泛研究。其中白藜芦醇（resveratrol）、白皮杉醇（piceatannol）、蝶芪（pterostilbene）及银松素（pinosylvin）都具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及抗菌等功能，而且在分子结构上类似，被广泛研究。

COVID-19像SARS冠状病毒一样，利用血管紧张素转化酶-2（ACE2）作为宿主细胞的受体，利用突刺蛋白进入支气管上皮细胞。然而COVID-19的入侵性、传染性及致死性比SARS更高，是因为COVID-19病毒蛋白的新颖性和高度重组性。因此，考虑到二苯乙烯类的抗病毒及抗菌活性，本研究利用计算模拟手段筛选确定二苯乙烯类是否可作为抗冠状病毒的候选药物（图1所示）。 

图1 计算模拟流程

二．材料和方法

2.1配体及蛋白结构

四种配体化学结构从Chemspider数据库（http://www.chemspider.com/）中下载，构建二维结构可用Chem office 2004，配体结构优化用UCSF Chimera 1.14。突刺蛋白和ACE2受体（S-ACE2）复合物蛋白结构从RCSB PDB数据库中下载，PDB ID为6VW1。

2.2 分子对接

分子对接软件是Autodock/vina。受体为6VW1，配体包括四种二苯乙烯类化合物及氯喹，其中氯喹被定为治疗COVID-19感染患者的药物，氯喹起对照作用。

2.3 动力学模拟

动力学模拟软件为Amber 18。首先对复合物蛋白结构进行溶剂化，盒子尺寸为8.0Å，水分子模型为TIP3P，力场采用ff14SB。添加抗衡离子，是体系呈电中性。模拟体系经过能量优化后，加热到300K跑NVT系综模拟，利用Langevin动力学和SHAKE算法限制氢键。之后跑100ps的NPT系综模拟，最后跑50ns的成品模拟。

2.4 MMPBSA计算自由结合能

MMPBSA是AMBER软件中附带的一种自由能分析方法，不但可以非常迅速的预测蛋白质分子与小分子的结合能力，同时准确度也非常高。自由结合能的数学表达式：

三．结果与讨论

3.1 分子对接

为了证明二苯乙烯类对新冠病毒S-ACE2复合物的抑制潜力和有效性，我们利用Autodock/via做分子对接研究。四种二苯乙烯类及氯喹都表现出对S-ACE2复合物良好的结合力，而且所研究的化合物对S-ACE2具有相似的结合模式（图2所示）。S-ACE2复合物中关键残基是Asn33、 His34、 Glu37、 Asp38、Lys353、Ala387、Gln388、Pro389、Phe390、Arg393、Lys403、Tyr453、Tyr495、Gly496、Phe497、Ser494 and Tyr505。5种小分子与关键残基通过疏水、亲水以及氢键和离子键相互作用结合在一起（表1所示）。基于结合亲和力，白皮杉醇和白藜芦醇是与S-ACE2结合最优的化合物（表2所示）。利用LigPlot+和VMD进一步分析白皮杉醇和白藜芦醇分子对接时，配体与受体相互作用的区域2D和3D图（图3和图4所示）。

图2 预测结合口袋处所有化合物的结合构象

表1 结合口袋中在5Å内的相互作用

表2 二苯乙烯类与氯喹的结合亲和力 

 图3 分子对接2D图分析 （A）白皮杉醇2D图 （B）白藜芦醇2D图

图4 分子对接3D图 （A）白皮杉醇3D图 （B）白藜芦醇3D图

3.3 动力学模拟

为了验证S-ACE2与白皮杉醇、白藜芦醇对接后构象的稳定性，进一步优化对接后复合物结构，进行分子动力学模拟分析。从RMSD、RMSF及MM-PBSA计算自由结合能三方面分析模拟轨迹。RMSD常用来查看模拟的收敛性和蛋白的稳定性，通过与初始结构做对比来表征蛋白的稳定性。RMSF常用来计算原子位置的波动情况。RMSD和RMSF都可表征蛋白结构的变化，区别在于RMSD是对时间的平均，RMSF是对原子总数的平均。

白藜芦醇-蛋白体系的RMSD是最低的，该模拟体系在1ns之后达到平稳，一直贯穿到模拟结束，50ns过程中平均的RMSD值是1.78Å（图4所示）。RMSD处于一个动态平衡过程中，这是因为配体一直在调整结合到活性位点处的位置。白藜芦醇-蛋白体系的RMSF波动小于白皮杉醇-蛋白体系，白藜芦醇-蛋白体系RMSF平均值是1.19Å（图4所示）。分析RMSF得到，S-ACE2与白藜芦醇相互作用的残基更加稳定，波动小。

基于以上分析得到，虽然白皮杉醇的结合亲和力大于白藜芦醇，但是分子动力学模拟表明白藜芦醇-蛋白体系使最稳定的，也是最适合进行下一步分析的复合物。

图4 RMSD和RMSF分析

3.3 MM-PBGBSA计算自由结合能

利用MM-PBGBSA计算自由结合能，不仅仅是验证分子对接的结果可靠性，还要分析发现白藜芦醇-蛋白复合物中其主导作用的相互作用能。利用MM-PBSA和MM-GBSA两种方法计算的自由能贡献（表3和表4所示）。两种方法计算得到的净自由结合能与分子对接的结果一致。利用MM-PBSA得到自由结合能是-20.2657 kcal/mol，MM-GBSA得到自由结合能是-23.8889 kcal/mol。两种方法中，气相能对系统总净能量的贡献中都是占比最高的，而系统的净溶剂化能揭示复合物的稳定性主要是因为受体相对于配体的最佳构象。

通过残基能量分解，可得到关键氨基酸残基对自由结合能的贡献，Asn33 (MM-GBSA 1.23 kcal/mol、MMPBSA 2.01 kcal/mol)，His34 (MM-GBSA 0.37 kcal/mol、MMPBSA0.01 kcal/mol)，Lys353 (MM-GBSA 0.37 kcal/mol、MMPBSA 0.11 kcal/mol)， Phe390 (MM-GBSA 0.58 kcal/mol、MMPBSA 0.45 kcal/mol)及 Gly496 (MM-GBSA 1.23 kcal/mol、MMPBSA 2.01 kcal/mol)。

表3 MM-GBSA计算自由结合能            表4 MM-PBSA计算自由结合能

总结：

1. 通过计算模拟二苯乙烯类与S-ACE2的结合能力，可能会反过来破坏SARS-CoV-2的宿主识别和感染途径，起到治疗COVID-19效果。

2. 二苯乙烯类的天然化合物，尤其是白藜芦醇可作为ACE2受体抑制剂，作为一种潜在的治疗药物。