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单细胞核糖体技术(scRibo-seq)为蛋白组学研究带来新变革
引文
尽管最近通过质谱分析仪在检测蛋白质方面取得了进展，但测量单细胞内的翻译仍然是一个重大挑战。近日，荷兰乌得勒支大学医学中心的研究团队在国际顶尖期刊Nature发表了题为“Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing”的文章。他们提高了分析的灵敏度，从而能够分析单细胞中的核糖体谱，为确定看似相同的细胞之间的翻译过程的显著差异提供了进一步证据。
背景介绍
单细胞测序技术，简单来说，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，因此单细胞测序方法已经能够深入分析多种生物的细胞类型和细胞状态的多样性。而鲜少有测量单细胞翻译过程的研究。此研究团队发现，对特定氨基酸的限制会导致核糖体在编码该氨基酸的密码子的子集处暂停，并且这种暂停仅在与其细胞周期状态相关的细胞亚群中观察到。最后，他们证明了这项技术适用于罕见的原发性肠内分泌细胞。该研究有重要的开创性成果：1）证明单细胞核糖体测序(scRibo-seq)能够实现单密码子的分辨率；2）极大地提高了单细胞核糖体检测的敏感性，使得在单个细胞中对核糖体进行分析成为可能。这项技术也是第一次证明了看似相同的细胞，他们的翻译过程可能存在显著多样性。
主要研究内容及结果
1.scRibo-seq可用于解析单细胞翻译
首先，研究人员通过scRibo-seq技术将核酸酶印迹、小RNA文库的构建和富集相结合，用来测量单细胞中的翻译动力学(图1a)。通过将这一过程直接整合到一个反应体系中，发现能够显著提高现有核糖体分析技术的灵敏度和可扩展性。步骤简述如下：1）将单个活细胞分选到含有环己酰亚胺的裂解缓冲液中，以稳定和停止转录物上的核糖体；2）暴露的核糖核酸（RNA）随后被微球菌核酸酶(MNase)消化，产生的核糖体保护足迹(RPFs)被释放；3）这些足迹通过连接含有唯一分子标识符(UMI)的引物位点的接头而转化为测序库，用于随后的cDNA合成和聚合酶链反应（PCR）；4）最后将反应产物汇集并选择合适的PCR产物，以富集符合典型RPF长度的插入片段进行测序。
然后，为了验证这种方法，研究人员从HEK 293T和hTERT RPE-1细胞系构建了scRibo-seq文库。得到的单细胞文库检测到3348±15个基因，每个细胞具有10451±85个独特的读数，并表现出核糖体分析实验特有的几个特征(图1b，c)。随后发现，第一，片段主要映射到编码序列(CDSs)(图1b，c)，其5ʹ末端在起始密码子上游约15个核苷酸位置显著富集，在终止密码子上游约18个核苷酸位置显著减少(图1b，左和右)。第二，起始密码子和终止密码子的局部密度都增加了(图1b)，它们来源于翻译起始和终止阶段的核糖体。第三，片段的5ʹ末端显示出沿CDS的清晰但适度的3个核算酸周期性(图1b)。最后，对常见污染物、不同生物类型以及蛋白质编码基因的非翻译区(UTRs)和CDS的定位频率都与常规核糖体分析方法相似。
图1.scRibo-seq测量单细胞翻译状态
a. scRibo-seq工作流程示意图。（BCD,条形码;FACS，荧光激活细胞分选）；b. 起始密码子周围(左)、CDS(中)和终止密码子周围(右)沿元基因区域排列的核糖体印迹折痕变化热图，显示了每次读取的5末端的映射坐标；c. RPF定位频率在蛋白编码转录本5个UTR、CDS和3个UTR区域的区域长度归一化分布。
2.单细胞翻译的异质性
研究团队通过在分选前从HEK293T培养基中去除精氨酸和亮氨酸，然后在3和6 小时后比较预测的E、P和A位点密码子占位的变化，观察处理后特异性的停顿现象，验证了scRibo-seq测量翻译动力学 (图2A)。核糖体图谱显示，这种暂停表现为受影响密码子的足迹密度增加。
值得注意的是，在每种限制条件下，只有一部分细胞表现出暂停反应(155个细胞中有41个来自精氨酸限制，202个细胞中有24个来自亮氨酸限制)。利用每个CDS的RPF计数对细胞进行聚类，识别出由细胞周期标记基因区分的4个簇(图2C，f)。在这些簇的基础上，研究人员发现细胞周期状态、氨基酸限制对翻译暂停存在显著影响。在精氨酸限制下暂停的细胞中，绝大多数(89.7%)处于早期(第2群，5个细胞)或晚期(第1群，30个细胞)S期，而对亮氨酸限制有反应的细胞与任何群集(UUA：P = 0.33)(图2D)没有显著关联
核糖体在单个基因上的停顿位置在单细胞核糖体测序数据中也很明显。如，H3C2是在精氨酸缺乏下CGC暂停增加的基因之一，检查H3C2上的RPF密度，揭示了几个暂停热点(图2e，g)。这些区域中最突出的包括两个连续的CGC密码子(图2e)，潜在地解释了与该转录物上的其他相同密码子相比，该位置的密度增加的原因。此外，这些重复密码子可能导致图2b中所示的A和P位点下游的CGC和CGU占有率的增加。
图 2:氨基酸限制下的核糖体功能暂停
a.核糖体出口(E)、肽基(P)和氨基酰(a)位点的密码子占位（FC：褶皱变化）;b.核糖体活性位点相关的密码子占位折叠变化的热图。c.单细胞RPF库的UMAP (n = 421个细胞)显示导出的簇(虚线轮廓)和限制条件(点颜色)。UMAP和聚类是通过每个CDS的RPF计数来确定的。d. UMAP分析显示，在精氨酸-(上)和亮氨酸-(下)限制条件下，密码子占位的平均对数倍变化。e. 根据细胞整体精氨酸停顿进行分类和分组的细胞沿H3C2切片p位点占位的平均值。f. 热图显示每个细胞簇的最高标记基因每CDS的RPF计数。d、g. 显示，热图显示沿H3C2的单细胞p位占用，细胞按平均CGC和CGU占位排序
3.翻译调控在细胞周期中的变化
翻译调控以前被认为是一种重要的细胞周期控制机制，然而这些研究只是粗略地解析了细胞周期的主要状态，并且依赖于用同样作用于翻译机制的方法来捕获或同步细胞。此次研究人员从3276个表达荧光泛素化的细胞周期指示物(FUCCI)的单个hTERT-RPE-1细胞中产生scRibo-seq文库，所有FUCCI从不同的细胞周期中获取(图3a，f)。利用每个CDS的RPF计数对单细胞进行聚类，确定了八个群体(图3b)。通过伪时序分析进一步解决了细胞周期中的这一进程，通过均匀流形近似和投影(UMAP)(图3c)建立了和FUCCI标记(图3h)相似的轨迹，并鉴定了在翻译动力学中存在显著差异的1853个基因。
他们发现在细胞周期中出现频率变化的密码子表现出位点特异性变化，有四个密码子的A位点占位增加(GAA、GAG和AUA)或减少(CGA)，而其他活性位点保持不变(图3i)。其中，A位点的停顿比GAA位点的增加更为显著，且具有阶段特异性(图3i，j)。然而，并不是所有的密码子都遵循同样的趋势。例如，处于有丝分裂晚期的细胞表现出比有丝分裂早期的细胞更明显的AUA暂停(图3i，k)，而与其他阶段相比，有丝分裂和G0细胞的CGA暂停减少(图3i)。
A位点暂停的变化是全局性的，影响了大多数翻译基因。比较每个簇和背景之间RPFA位点GAA密码子出现的基因频率，研究人员发现大多数基因在有丝分裂期间经历了GAA暂停的增加(图3M)。这些A位点暂停的阶段特异性变化可能反映了有丝分裂期间翻译延伸动力学的全局变化。
图3. 细胞周期中的翻译暂停
a、e. 通过每个CDS的RPF计数测定UMAPs(n=3276个细胞)，包括细胞组分(a).细胞簇(b).伪时间轨迹 (c).单体Kusabira-Orange-2(mKO2)CDT1标记荧光 (d).和单体Azami-Green(mAG)GMNNFUCCI标记荧光.(e)f-h标记(n=3276个细胞)的散点图，颜色表示细胞组分(f)，细胞簇(g)和假时间轨迹(h)，如a-c.i，热图显示基于细胞周期进展排序的单个细胞中核糖体位点特定的密码子暂停；j,k. UMAP分析显示GAA暂停(j)和AUA暂停(k)；I. 热图显示沿MYL6CDS的RPFA位点分布。细胞的排列是基于细胞周期的进程。GAA密码子在图的顶部用标记表示。m. 散点图显示背景下每个细胞簇的基因A位点频率的折叠变化。
4. scRibo-seq在罕见细胞中的应用
此外，在细胞系上证明了scRibo-seq后，研究人员为原代小鼠肠道内分泌(EEC)细胞生成了核糖体图谱，EEC细胞是胃肠上皮(不到1%的细胞)中的一种稀有细胞（图4）。最后通过已建立的激素标记基因的翻译，确定了代表主要EEC细胞类型的8个簇(图4)。结果发现GAA暂停的细胞群只出现在肠嗜铬细胞群的晚期(29个细胞中有6个)，而CAG暂停的细胞分布在众多细胞群之间。
图4. 小鼠原代肠EEC细胞的单细胞核糖体分析
全文总结
此研究通过scRibo-seq技术测量单细胞水平的翻译过程，填补了现有的单细胞基因组学技术的空白，scRibo-seq提供了一种无标记和无转基因的核糖体分析方法，其灵敏度和分辨率可测量单个细胞群体中特定转录本上的核糖体行为，分辨率可达到单个密码子。与最近描述的Ribo-STAMP26相比，scRibo-seq提供了翻译的瞬间快照，具有单密码子分辨率，不需要表达外源性融合蛋白。这些独特的能力使我们能够详细地研究哺乳动物细胞周期中的翻译，为有丝分裂期间翻译调控的广泛改变提供了证据。此外，研究人员将scRibo-seq应用于原代EEC细胞，证明scRibo-seq可以直接应用于复杂的原代样本，从而能够测量稀有细胞群体中的翻译动力学。
