大家好，今天给大家介绍一篇今年4月份发表在nature communications（IF=12.556）上的文章。

An integrated multi-omics analysis identififies prognostic molecular subtypes of non-muscleinvasive bladder cancer

一项综合的多组学分析确定了非肌肉浸润性膀胱癌的预后分子亚型

摘要

非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)的分子景观具有很大的生物学异质性和不同的临床结果。在这里，我们对诊断为NMIBC的患者(n = 834)进行了综合多组学分析。转录组学分析确定了四类(1,2a, 2b和3)，反映了肿瘤生物学和疾病侵袭性。除了既定的预后临床病理参数外，转录组基础的分型和染色体不稳定性水平都提供了独立的预后价值。高染色体不稳定性、p53通路中断和APOBEC相关突变与转录组2a类和不良预后显著相关。RNA介导的免疫细胞浸润与染色体不稳定肿瘤相关，富集于2b类。空间蛋白质组学分析证实了较高的2b类肿瘤浸润，并证明了较高的免疫细胞浸润和较低的复发率之间的关联。最后，使用单一样本分类工具在1228个验证样本中记录了转录组分类的独立预后价值。该分类器提供了一个框架，生物标志物发现和优化治疗和监测下一代临床试验。

二、结果

NMIBC中转录组分类的描述

本文分析了535例患者的RNA-Seq数据(397 Ta, 135 T1, CIS)。使用非监督共识聚类的基因表达值限制在4000个变异最大的基因在整个数据集，确定了四个转录组类别。然后使用多变量Cox回归分析，经临床EORTC风险评分(欧洲癌症研究和治疗组织24)和EAU(欧洲泌尿外科协会)风险评估调整后，高危2a和2b类与PFS和RFS较差独立相关。转录组学分类与各种临床病理参数显著相关。使用Lund系统进行分类显示，91%的肿瘤被归类为UroA，4%的肿瘤被归类为基因组不稳定(GU)，后者大多出现在2a类。与NMIBC类相关的生物过程分析揭示了从分子分类和结果中区分经典组织学特征的重要信息。1类和3类肿瘤与早期细胞周期基因相关。此外，3类肿瘤的特征是FGFR3共表达基因高表达和免疫环境缺失。相反，2a类肿瘤大多与晚期细胞周期基因、DNA复制、蛋白和参与细胞分化的基因相关，从而表明分化和增殖不显示负相关。此外，2b类肿瘤主要与肿瘤干细胞标志物的表达相关和参与EMT的基因，但与细胞增殖的相关性较小。然后本文通过RNA-Seq数据的反褶积来估计免疫细胞的存在。2b类肿瘤的总免疫浸润评分明显高于其他类肿瘤，提示免疫细胞浸润水平高。为了进一步探索NMIBC类别之间的转录组差异，本文分析了23个预先确定的转录因子(即调控因子)的转录调控网络(即调控因子)，这些转录因子先前研究了MIBC和癌症中与染色质重构相关的候选调控因子。这种分析提供确认的生物相关性四个亚型分类,作为调节子活动是高度相关的转录组类。

根据病理特征分层的转录组亚型

为了减少病理和形态学差异引起的生物学混淆，本文对T1高级别肿瘤(n = 101)进行了亚分析。对T1低级别肿瘤进行非监督共识聚类分析，将基因表达值限制在2000个变异最高的基因上，确定了三种亚型:一个较大的组(T1HG- 2)，富集于1、2b和3类肿瘤，具有较高的早期细胞周期和FGFR3共表达基因和相对较好的结果，以及两个较小的2a类肿瘤亚型。

然后构建了一个单样本T1HG分类器，对535个肿瘤进行了分类。T1HG亚型与PFS显著相关，多变量Cox回归分析显示，T1HG-1与临床EORTC和EAU风险评分调整后的PFS和RFS较差独立相关。

染色体不稳定与高危NMIBC有关

为了进一步研究NMIBC的基因组异质性，本文使用illumina SNP阵列对473对肿瘤白细胞进行了分析。基因组丢失/获得和等位基因不平衡来自原始片段的总拷贝数和B等位基因频率值。EORTC风险评分分层肿瘤的基因组图谱分析显示了类似的异常模式，但基因组(除了9号染色体丢失)在EORTC高危肿瘤中更常见。因此，肿瘤被分层为3个相同大小的基因组类(GC1- 3)，随着CNA负荷的增加，以说明低、中、高染色体不稳定性。基因组分类与PFS和RFS显著相关。重要的是，将生存分析局限于EORTC风险评分高的肿瘤，基因组类仍与PFS显著相关。基因组分类与分期、分级、伴随CIS和EORTC风险评分显著相关。

整合基因组改变和转录组类

对303个肿瘤的基因组和转录组数据的整合分析显示，转录组分类与基因组分类显著相关。2a类肿瘤占GC3的比例最高(68%)。为了进一步证明这种关联，本文发现基因组类别与基因qPCR进展风险评分之间存在强相关性(n = 449)，进展评分较高的肿瘤主要为2a级和2b级。当只分析2a类和2b类肿瘤时，基因组类仍然与PFS显著相关，所有进展事件均与GC3肿瘤相关。基于RNA-Seq数据，称具有中等或高功能影响的单核苷酸变异(SNVs)。2a类肿瘤的SNVs数量明显高于其他所有类。与DNA测序相比，基于RNA-Seq数据的突变调用有几个局限性，如果没有参考种系比较，则有在分析中包括种系变异的风险。本文比较了38例患者的肿瘤和种系的RNA-Seq和全外显子组测序(WES)，发现在我们所呈现的基因列表中，每个样本和跨样本使用的过滤方法显著富集了体细胞SNV。此外，疾病驱动基因的拷贝数改变(来自SNP微阵列分析)被突出来进行比较，并表明CDKN2A总体丢失，PPARG和E2F3在2a类中显著增加，RB1在2a类中丢失。值得注意的是，42%的肿瘤中p53通路改变，与高CNA负荷显著相关和2a类肿瘤。TP53在17个肿瘤中同时受到拷贝数变化和点突变的影响。DNA损伤修复基因突变与RNA衍生的突变负荷显著相关。此外，我们发现GC3肿瘤中的突变负荷和免疫细胞浸润显著升高。此外，本文推断出7个三核苷酸单碱基突变信号，其中4个信号与之前在膀胱癌中发现的信号具有高度相关性，SBS1(年龄相关)，SBS2和SBS13(与过量的APOBEC活性有关)和SBS5(与ERCC2突变有关39)。在APOBEC相关标记的背景下，2a类肿瘤有明显更多的突变。

肿瘤和免疫细胞的空间蛋白质组学分析

为了在空间水平上解决上述免疫特征，对167个肿瘤进行了多重免疫荧光和免疫非组织化学分析，其中有其他组织可用。我们分析了免疫细胞(T辅助细胞、TCL、Treg、b细胞、M1-和M2巨噬细胞;使用自动图像分析算法41研究免疫细胞的空间组织和免疫逃避机制。150例肿瘤的RNA-Seq数据可用，RNA衍生的免疫评分与肿瘤实质中浸润免疫细胞的水平显著相关。不同的淋巴细胞亚群主要同时存在于间质和肿瘤实质。因此，只有少数肿瘤属于免疫排除表型。因此，我们关注的是位于肿瘤实质的免疫细胞浸润的程度，因此称为免疫浸润。值得注意的是，高免疫浸润的肿瘤显示MHC I类高表达。只有少数肿瘤在肿瘤实质中表达PD-L1，大多数肿瘤呈高度炎症。蛋白质组水平的浸润免疫细胞水平与转录组分类显著相关，2b类肿瘤表现出最高的免疫浸润。尽管炎症2b类肿瘤的总体侵袭性特征，高免疫浸润与较低的复发率显著相关。很少有进展事件来证明这种对PFS的影响。此外，在基因组背景相似的肿瘤患者中显示出一种可能的保护性免疫反应(很少有基因组改变)，在本组中，高免疫细胞浸润患者的RFS较低免疫细胞浸润患者长。以前在尿路上皮样B肿瘤中也观察到基底样和发光样标记物的共同表达。CK5/6阳性细胞部分与转录组组相关，其中转录组组3对CK5/6表达的富集最强。

综合预测模型、分类器构建和独立验证

对所选的临床特征和分子变量的单因素Cox回归分析。此外，本文采用logistic回归模型(n = 301)进行受试者工作特征(ROC)分析来预测5年内的进展。总的来说，每个转录组有不同的临床特征、分子特征和肿瘤微环境。

最后将分类器应用于14个独立队列，包括3个未发表的数据集，共1228例患者的肿瘤通过广泛的平台进行分析。值得注意的是，与微阵列分析相比，RNA-Seq平台更适合调用3类肿瘤。总体而言，本文发现FGFR3和TP53中肿瘤分级与肿瘤分期、肿瘤分级与突变之间存在高度显著相关。且分级显示出显著不同的PFS，其中2a类肿瘤患者预后最差。

为了进一步验证UROMOL2021分类器，本文比较了发现队列与独立队列之间的调节活性和生物途径富集的差异。规则和路径分析证明了数据集之间的高一致性，支持了类的稳健性。

小结

作者以转录组为切入点，联合了基因组、蛋白质组，对非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)进行了一系列的分析。首先在转录组层面将NMIBC分为了四个类，反映了肿瘤生物学和疾病侵袭性，除了既定的预后临床病理参数外，转录组基础的分型和染色体不稳定性水平都提供了独立的预后价值。并发现了高染色体不稳定性、p53通路中断和APOBEC相关突变与转录组2a类和不良预后显著相关。RNA介导的免疫细胞浸润与染色体不稳定肿瘤相关，富集于2b类。空间蛋白质组学分析证实了较高的2b类肿瘤浸润，并证明了较高的免疫细胞浸润和较低的复发率之间的关联。最后，使用单一样本分类工具在1228个验证样本中记录了转录组分类的独立预后价值。