大家好呀！今天给大家介绍一篇2022年2月发表在Cancer Cell（IF:31.743）上的文章。一般的癌症治疗是以癌细胞为靶点并没有考虑肿瘤微环境，这可能对治疗效果有所影响。本研究作者发现直肠癌患者的炎症相关纤维细胞（iCAFs）与放疗和化疗不良反应有关。并对小鼠模型进行实验，结果表明IL-1α对诱导成纤维细胞转化为炎症表型并引起DNA损伤从而导致放疗和化疗抵抗和疾病进展，此外IL-1受体拮抗剂的血清水平较低与预后不良有关。总的来说，iCAF在直肠癌治疗抵抗中具有重要作用。下面，我们来看看这篇文章的具体内容吧~

结果：

1.炎症成纤维细胞预测直肠癌患者生存情况

首先，作者对212例接受放疗（CRT）治疗和手术治疗的直肠癌患者进行一致性分子亚型（CMS）分类。然而，不同CMS亚群患者的DFS并没有显著差异（图1A）。其次，为鉴定与预测治疗反应有关的标记物和信号通路，作者对CMS2亚群患者的肿瘤细胞进行蛋白质组分析共鉴定到2747种蛋白质，但PCA和聚类分析并没有将pCR和非pCR患者进行分开（图1B）。结果表明，可能是肿瘤微环境中的细胞决定患者对CRT的反应。此外，对接受治疗前的活检样本进行多重荧光免疫组化分析，其中间充质细胞显著富集，而T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和上皮细胞没有显著差异（图1C和1D）。转录组分析表明在非完全缓解（non-pCR）患者中CAF特征，上皮-间充质转化（EMT）和炎症特征显著富集（图1E）。结果表明，成纤维细胞与患者治疗反应受损有关。最后，对核心蛋白聚糖（DCN）的免疫组化分析表明，DCN是细胞外基质的组成部分，DCN高表达患者的DFS较差（图1F和1G）。

2.小鼠原位直肠癌模型

为了验证炎症型CAFs对直肠癌治疗的影响，作者构建小鼠直肠癌模型（图2A）。APTK类器官移植并表达APTKA，其肿瘤特征是明显的间质反应具有较强的侵袭性（图2B）。APTK和APTKA的肿瘤没有聚到一起（图2C）。APTKA肿瘤显示CAF相关基因显著富集（图2D）。为了进一步研究这些肿瘤中的CAFs，使用流式细胞仪对细胞进行筛选并进行单细胞RNA测序。这些细胞共聚为5类，其中炎症型依赖IL-1簇0最为显著（图2E）。该簇的DEG包括DCN（图2F），免疫组化分析表明DCN水平较高（图2G）。对APTK和APTKA的肿瘤进行放疗，其中APTK对放疗反应良好（图2H），肿瘤体积减少（图2I和2J）。而APTKA放疗后，APTKA对放疗耐药（图2K），侵袭性更强且肝转移率更高（图2L-2N），并且DCN+成纤维细胞数量增加，成纤维细胞形态改变和胶原蛋白含量增加（图2O）。此外，对体外APTK和APTKA组织进行放疗，结果与之类似（图2P-2R）。

3.耐药肿瘤以IL-1α依赖的方式诱导炎症型CAF极化

为研究APTK和APTKA肿瘤是否会以旁分泌的方式影响肿瘤周围的成纤维细胞，作者收集两个肿瘤的上清液并用两种野生型小鼠肠道成纤维细胞培养24h（图3A）。转录组分析表明两个组织上清液的成纤维细胞的基因表达模式不同（图3B）。GSEA分析表明，APTKA的成纤维细胞具有较强的炎症极化（图3C）,簇0显著富集（图3D）。APTKA成纤维细胞中iCAF显著富集（图3E）。此外，用APTKA处理野生型成纤维细胞，会显著抑制促炎基因（图3F）。作者的目标是鉴定APTKA分泌的上游因子，其负责激活成纤维细胞的NF-B和p38。因此，作者对APTK和APTKA进行转录组测序分析，其中编码细胞因子的基因差异表达（图3G）。

4.IL-1与原位肿瘤的治疗耐药有关

为验证IL-1α阻断是否会改善体内APTKA对放疗的反应，作者采用阿纳金拉处理小鼠10天（图4A），放疗后，小鼠的肿瘤大小和侵袭性会显著降低（图4B-4D）。DCN+细胞减少，CD8+ T细胞增多，巨噬细胞和中性粒细胞浸润水平降低（图4E）。IL-1R缺失的成纤维细胞中可以模拟阿纳金拉处理的接受放疗小鼠的效果（图4F-4I）。此外，作者使用CRISPRa/Cas9激活放疗的APTK组织中的IL-1α转录（图4J和4K）。IL-1α的增加会使肿瘤对放疗产生抵抗力（图4M）。而APTK-sall1a肿瘤大小没有变化但侵袭性和转移性更强（图4M-4O）。放疗后IL-1α依赖性的巨噬细胞和中性粒细胞浸润水平没有增加（图4P）。

5.IL-1信号转导导致亚硝酸盐介导的DNA损伤，进而引起炎症型CAFs治疗性衰老

为了研究APTK和APTKA极化成纤维细胞时是否会受到放疗的影响，作者使用APTK和APTKA条件培养基处理原代成纤维细胞并进行放疗（图5A）。不同处理的成纤维细胞形态具有显著差异，APTKA极化的成纤维细胞形态是细长的纺锤形，APTKA和ILr1处理后的细胞接受放疗后其形态有所变化（图5B）。随后，作者收集放疗前后的APTKA极化成纤维细胞的上清液使用质谱分析ECM组分，其中ECM糖蛋白，胶原和蛋白多糖等显著增加（图5C）。对接受放疗前后的成纤维细胞的转录组数据进行分析，结果表明参与细胞周期和细胞周期检查点的基因显著下调（图5D）。免疫印迹分析表明p21，CDK4，细胞周期蛋白D2水平升高而CDC2/CDK1和细胞周期蛋白A水平降低（图5E）。免疫荧光表明p21积累，Sa-β-gal染色表明放疗后成纤维细胞衰老并伴随DNA损伤（图5F）。在APTK，APTKA，IL-1α处理72h后，成纤维细胞上清液中的亚硝酸盐水平显著升高（图5G）并且DNA损伤增加（图5H）。然而，使用Nos2抑制剂W1400或通过anakinra抑制IL-1信号转导会阻断亚硝酸盐的产生，进而防止成纤维细胞的DNA损伤和衰老（图5H和5I）。

作者鉴定到APTKA肿瘤的间质细胞核中p21显著增加，放疗后SA-β-gal阳性间质细胞显著增加（图6A）。随后，作者将APTKA肿瘤移植到Trp53小鼠体内，结果表明IL-1α条件下对放疗处理后的Trp53缺失成纤维细胞具有衰老抗性。因此，在具有Trp53/间质的小鼠中，APTKA肿瘤对放疗效果较好，肿瘤体积显著减小，侵袭性肿瘤生长减弱（图6B-6H）。此外，用C57BL/6+ venetoclax对肿瘤进行药物靶向（图6I）。APTKA肿瘤接受放疗后，肿瘤负荷显著下降（图6J），还会抑制肿瘤侵袭和肝转移（图6K和6L），DCN+细胞减少和CD8+ T细胞浸润水平增加（图6M-6O）。

6.低水平IL-1ra会增强直肠癌患者的IL-1信号转导进而使CAFs更易发生治疗性衰老

最后，作者使用小鼠模型研究IL-1α诱导的肿瘤微环境变化是否与直肠癌患者治疗反应不良有关。作者对治疗前血清样本进行Bio-Plex分析，结果表明IL-1β和其他细胞因子，趋化因子没有显著差异（图7A）。然而，在non-pCR伴随淋巴结转移的患者和接受CRT且预后不良的患者中IL-1ra的水平显著降低（图7B）。已有研究表明IL-1ra与rs4251961 T/C和rs579543 G/A这两个SNP有关。作者的结果表明纯合子rs4251961 T/T患者中血清IL-1ra水平升高，但IL-1ra与rs579543没有相关性（图7C）。在接受CRT治疗的患者中，接受治疗前IL1RN低表达水平与DFS较差有关（图7D）。对接受CRT前后的患者进行PCA聚类，可以清晰的聚为两类（图7E）。CRT会诱导EMT,ECM和胶原形成（图7F）。免疫组化结果表明，CRT会诱导基质细胞反应（图7G和7H）和p21积累（图7I）。作者从6例接受CRT的患者和手术患者的活体组织中构建PDO，其患者的IL-1ra和IL-1α具有显著差异（图7J）。对正常样本和接受CRT的患者检测炎症基因和亚硝酸盐水平，其患者的炎症基因和亚硝酸盐水平具有显著差异（图7L和7M）。成纤维细胞的SA-β-gal染色表明，IL-1ra-低处理的成纤维细胞接受放疗后，成纤维细胞发生较强的衰老（图7N）。

结论：

已有研究表明放疗和化疗都会对CAF在内的基质成分产生影响，同时CAF同样会对放疗效果产生影响。作者的结果表明肿瘤细胞和CAF之间的相互作用会影响化疗对直肠癌的作用。总的来说，作者使用生物信息分析和实验相结合的方法强调了CAF对直肠癌患者治疗反应的影响。

参考文献：

Nicolas A M , Pesic M , Engel E , et al. Inflammatory fibroblasts mediate resistance to neoadjuvant therapy in rectal cancer. 2022.