各位早上好吖，由于工作原因，小编近期对基因编辑产生了浓厚的兴趣，虽然前几年相关话题此起彼伏，从18年贺建奎教授因为对双胞胎婴儿进行非法基因编辑而获刑，到2020年诺贝尔化学奖颁发给两名开发了CRISPR/Cas9编辑技术的科学家，这项如同自带热搜体质的女明星般存在的技术，在科研界和社会上都引起了热议。作为一枚单纯的吃瓜群众，虽然每次小编都忍不住直呼“这么神奇的吗？？？”，但终究还是走马观花，没有啃到瓜心！所以呢，今天大家就陪小编一起来揭开这位流量明星的神秘面纱吧。

基因编辑的发展史

一说到基因编辑，自然而然就会联想到转基因，其实这哥俩无论是从原理还是技术上，都有着本质的区别。转基因技术是将可表达优良性状的外源基因片段重组到生物体内，是对基因组做加法，而基因编辑则是对基因组本身定向地进行核苷酸序列的替换、敲除、插入等操作，难度更大，精准度更高，因此也被称为“基因组的剪刀”。 如图1所示，邱志超等人简单总结了几大基因编辑技术的发展线。其实，在20世纪70年代和80年代，就有科学家分别对酵母和小鼠的基因组做过靶向改变，但当时由于重复难度大、效率低，以及缺乏其他哺乳动物可培养的胚胎干细胞，并没有引起太大的波澜，直到锌指核酸酶的出现。

基因编辑有三宝

基因编辑技术的核心是在感兴趣的基因组序列创建位点特异性的DNA双链断裂(DSB)，靶细胞对DSB有两种修复机制：非同源末端结合（NHEJ）和同源重组修复（HDR）。NHEJ不需要任何模板，修复蛋白直接将断裂的DNA末端拉近，在DNA连接酶作用下重新结合，NHEJ修复机制出错的概率比较高，可能会发生局部的InDels，使得基因丧失功能，这样的基因编辑通常称之为基因敲除。而当细胞核内存在与损伤DNA同源的片段时，就可能发生HDR，因此可以在要转入的基因两端加同源臂，将设计的外源基因插入到目的位点，这样的基因编辑称之为基因敲入。

目前，用来制造DSBs的三大核酸酶包括：锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)。ZFNs由Fok I限制性内切酶产生的非特异性DNA裂解结构域与决定其特异性的锌指蛋白结构域共同组成，一个锌指单元结合3-bp DNA，通过在目标区域5-6bp间隔序列的两侧设计两个锌指基序，Fok I核酸酶就可以在间隔序列内引入DSB，刺激DNA损伤修复机制。ZFNs技术的出现在一定程度上揭开了基因编辑发展的序幕，在很长一段时间内，ZFNs技术一直是创建位点特异性DNA结合蛋白和酶的唯一方法。但是构建一个特异的锌指蛋白较为费时费力，而且成功率低易脱靶，细胞毒性大，再加之Sangamo Biosciences公司的垄断，这种商业化模式使得很难将其作为一项常规的实验室技术，这在某种程度上催生了第二代基因编辑技术TALENs。

TALENs简单直接的设计为研究人员提供了又一个可选择的基因编辑平台，经济高效性使其得到爆炸性发展。TALE蛋白首次在植物病原体黄单胞菌属中被发现，包含一系列高度保守由33~35个氨基酸组成的重复单元，其第12和13位为两个可变氨基酸(RVD)， RVD可以识别DNA四种碱基，并特异性结合DNA序列。将TALEs与二聚化后才能发挥功能的Fok I核酸酶融合在一起，就构成了TALENs。同ZFNs的三联体结合相比，TALE-DNA结合重复序列的单碱基识别更具灵活性，但由于相同重复序列的广泛存在，对重复TALE序列的克隆也提出了更高的技术要求。此外，该技术依赖上下游序列，存在脱靶现象，也有一定的细胞毒性，还有研究表明该技术在啮齿类动物胚胎中效果较差。

CRISPR/Cas系统是目前在哺乳动物细胞中进行基因编辑的较为有效的一种技术，CRISPR广泛存在于原核生物中，由一系列来自噬菌体或质粒DNA的间隔序列区和高度保守的重复序列区组成。CRISPR系统的序列特异性沉默依赖于crRNA和tracrRNA，CRISPR RNA (crRNA) 碱基对与tracrRNA (反式激活嵌合RNA) 形成一个双RNA结构——sgRNA，引导cas9内切酶到互补的DNA位点进行切割。同ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9系统通过sgRNA 进行定位，对不同位置的识别仅需要调整sgRNA上前20个碱基，显著降低了哺乳动物基因编辑的工具构建成本和时间。同时，CRISRP/Cas9系统核酸内切功能（Cas9）与定位功能（sgRNA）相互独立的特征也与上述两种基因编辑技术不同，只需要同时在细胞内表达Cas9 蛋白和多条sgRNA，即可在同一细胞中同时进行多个位点的基因编辑，明显增加了编辑效率和研究应用范围。此外，CRISPR/Cas9特异性识别的PAM (crRNA上的原间隔子相邻基序)序列在哺乳动物基因组中广泛存在，因此可编辑的位点也显著增加。CRISPR/Cas9系统为生成合适的人类疾病动物模型提供了复杂和灵活的基因靶向工具，该系虽然具有较高的编辑效率及操作简便和成本低廉等优点，但仍未摆脱脱靶效应。

路漫漫其修远兮

有着”上帝的手术刀”之称的基因编辑技术，目前已广泛应用于植物培育、细胞动物模型的构建、癌基因和药物靶点的筛选，在基因治疗中也拥有巨大的发展前景，为单基因遗传病、癌症等疾病提供了新的治疗方法。比如，最早的临床试验是利用ZFNs 技术编辑CCR5基因抵抗HIV，研究者从HIV 病人中提取T 细胞，干扰CCR5 基因的表达可以抗HIV 感染；TALENs被用来提高治疗性CAR T细胞的疗效；基于CRISPR/Cas9技术的案例更是数不胜数，Nguyen等人基于CRISPR/Cas13d系统，利用腺相关病毒AAV将其递送至COVID-19感染患者的肺部，从而达到清除病毒的目的。相较于人类，基因编辑技术在农业上的应用更加广泛，如通过基因编辑生产具有抗病性的小麦、无角的奶牛、肌肉含量更高的猪羊等可食用动物。

由于技术层面以及社会伦理的原因，现在基因编辑治疗疾病仍处在临床前或者临床研究阶段，还没有真正获批的基因治疗药物。毕竟，人体是相当庞大复杂的系统，对于每个基因的功能我们还尚未达到完全了解的地步，很难保证不会牵一发而动全身。不过，可以肯定的是基因编辑将继续成为科研、商业和临床医学中广泛应用的工具，对于其发展方向，我们大可不必为之过度担忧，就像五条人的那首歌“当问题出现了再告诉大家”，有了问题，相关的法律法规才能不断完善。况且，对于基因编辑，各国都坚守着一个共识：禁止对人类生殖细胞进行基因编辑，可遗传的人类基因改造是生物与医学研究人员不能触碰并且要共同守住的伦理道德底线。

未来，基因编辑这把利剑的作用能发挥到何种程度，小编非常好奇，翘首以待！好了，今天的分享到此结束，have a nice day！

参考文献：

1、Mashimo T. Gene targeting technologies in rats: zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Dev Growth Differ. 2014 Jan;56(1):46-52. doi: 10.1111/dgd.12110. Epub 2013 Dec 27. PMID: 24372523.

2、Carroll D. Genome Editing: Past, Present, and Future. Yale J Biol Med. 2017 Dec 19;90(4):653-659. PMID: 29259529; PMCID: PMC5733845.

3、Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405. doi: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004. Epub 2013 May 9. PMID: 23664777; PMCID: PMC3694601.

4、 昆明理工大学学报.基因编辑技术及其在疾病治疗中的研究进展和应用前景.邱志超，李卓霏，石　宏. 2021年10月第５期第46卷. doi:10.16112/j.cnki.53-1223/n.2021.05.252.